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Materiales y Métodos correspondiente de acuerdo al anticuerpo primario utilizado, se lavaron e incubaron durante 1 hora con el complejo avidina‐peroxidasa biotinilada (kit Vectastain Elite ABC). Finalmente se revelaron con el sustrato 3,3’‐diaminobencidina comercial en presencia o ausencia de Níquel de acuerdo a la IHQ realizada, generando un precipitado negro‐violeta o marrón, respectivamente. Los anticuerpos primarios y secundarios se detallan en la Tabla 1 6.2.2 IHQ cromogénica doble (c‐Fos/orexina o TH) Luego de realizar una IHQ simple contra c‐Fos revelada con DAB/níquel, las secciones de cerebro se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con el segundo anticuerpo primario. Luego del tiempo de incubación correspondiente al anticuerpo utilizado, se lavaron las secciones y se incubaron con el anticuerpo secundario por 1 hora. Posteriormente, las secciones se lavaron, se incubaron por una hora con el kit avidina–biotina–peroxidasa y finalmente la señal visible se reveló con DAB sin solución de níquel (Tabla 1) 6.2.3 IHQ simple contra orexina y doble contra TH y orexina dentro del AVT Secciones cerebrales conteniendo el AVT se usaron para la detección de señal inmunoreactiva para orexina usando el anticuerpo anti‐orexina y se reveló la señal con DAB/Níquel obteniendo un precipitado negro/violáceo como se indicó anteriormente. Secciones cerebrales independientes conteniendo el AVT se usaron en primer lugar para la detección de células inmunoreactivas para TH. Se obtuvo un precipitado marrón al revelarlo con DAB sin solución de níquel y luego se continuó incubando las mismas secciones cerebrales con el anticuerpo anti‐ orexina. Esta IHQ se reveló con DAB/ Níquel dando una señal negro/violácea. 48
Materiales y Métodos 6.2.4 IHQ fluorescentes Las secciones coronales de los cerebros de ratón se lavaron y se incubaron directamente con solución bloqueante durante 1 hora. Luego se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente. Posteriormente, la secciones se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario por 2 hs.(Tabla 1) Específicamente, para las muestras provenientes de los experimentos de trazado neuronal, las secciones cerebrales a las que se les realizó una IHQ contra c‐Fos, se utilizaron para la detección de señal inmunoreactiva de orexina mediante una IHQ fluorescente. Para esto, luego de lavar las secciones se incubaron con anti orexina. Al día siguiente, se incubaron con el anticuerpo secundario anti‐conejo Alexa 488 durante 2 hs. 6.2.5 Coloración de Nissl. En primera instancia se montaron las secciones secuencialmente en portaobjetos de vidrio, luego se lavaron durante 1 minuto en agua destilada y se incubaron en solución de tionina durante 20 minutos. Posteriormente, se deshidrataron las secciones pasándolas 1 vez durante 1 minuto por agua destilada, luego 2 veces de 1 minuto cada una por alcohol 96°, 2 veces de 1 minuto cada una por alcohol 100° y por último 5 minutos por xilol. Finalmente, se colocaron los cubreobjetos con medio de montaje. Esta coloración sirve para teñir los cuerpos de Nissl, que son acumulaciones basófilas, que se encuentran en el citoplasma de las células nerviosas. 49
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