UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE ...

3. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN: MATERIAL Y MÉTODO
En cada conejo se inyectaron dos dosis de 200 UI/kg de peso de SOD disueltas
en SS, la primera administrada con jeringuilla en bolo endovenoso inmediatamente
antes del desclampaje de la AMC, y la segunda, administrada mediante microinyector
de precisión, durante los 10 primeros minutos de reperfusión, contados a partir de la
retirada del clamp.
Estas dosis se aplicaron tanto para las series del estudio de supervivencia con
SOD (serie VI) como para las del estudio de la peroxidación lipídica con SOD (serie
IX).
A los animales de las series VII y X se les aplicó únicamente solución salina
fisiológica, inyectandoles dos dosis de 0,33 ml/kg, la primera en bolo y la segunda con
microinyector, inmediatamente antes de la retirada de la pinza de oclusión de la AMC y
durante los primeros 10 minutos postenores respectivamente.
3.2.6 Estudio de la peroxidación lipidica en segmentos intestinales
Se emplearon tres series; la serie VIII (TBA-C) de 5 animales (TBA-C),
utilizada como control para averiguar los niveles de MDA en los segmentos intestinales
obtenidos de los animales no sometidos a isquemia, aunque sí al resto del proceso
quirúrgico (operación simulada).
La toma de muestras se hizo a cada conejo, según lo expresado en 3.2.3.
Metodología quirúrgica.
Otras dos series, la IX y X (TBA-SS y TBA-SOD), de quince animales cada
una, fueron sometidas a laparotomía media y clampaje de la AMC, produciendo una
isquemia intestinal de 1 hora de duración. Al ténnino de esta se administró a la serie IX
una solución de SOD en SS y a la serie X, únicamente solución salina según la
metodología descrita en 3.2.5, permitiendo una reperftisión de 1 hora tras retirar el
clamp. Al final de esta hora, los animales fueron sacrificados, tomando una muestra de
5 cm de pared intestinal de la porción central del yeyuno, para su análisis mediante el
test del TEA, según el método de Ohkawa et al, que se describe a continuación:
1. Pesar en balanza 50 mg de pared intestinal y depositarla en un homogeneizador
Ten-Broek preenfriado a -20 0C.
2. Agregar 1 ml de tampón fosfato de pH 7, macerando hasta homogeneizar la
mezcla.
3. Centrifugar a 5500 rpm durante 20 minutos a temperaturas entre O y 50C.
4. En un tubo de ensayo se depositan 140 pl del sobrenadante y se agrega 1 ml de
ácido fosfórico al 1% con el fin de detener la producción de RL, 33 pl de butilhidroxi-tolueno
(BHT) diluido al 0,01% en alcohol etílico para impedir la
neoformación de RL y 0,6 ml de TEA al 0,6% diluido en agua destilada, como
reactivo de color frente al MDA, sometiendo la mezcla a ebullición con
agitación suave, durante 45 mm, apareciendo una tonalidad rosada.
5. Enfriar en baño con hielo y agregar 1,4 ml de n-butanol para disolver la fase
orgánica, agitando el tubo y centrifugando a 4000 rpm durante 15 mm. a una
temperatura entre O y 50C.
6. Del sobrenadante o fase orgánica, se toma la cantidad necesaria en una cubeta de
espectrofotómetro, para realizar una lectura a 535 ~m de longitud de onda.
Para la obtención de los valores estándar, se preparó una solución madre de MDA a
una concentración de 706 ~M MDAImI. Esta solución se diluyó al 1/10 en tampón
fosfato de pH 7, quedando la nueva solución a concentración de 70,6 ~M MDA/ml, a
74