Freie Vorträge und Poster - Jahrestagung DDG 2012

skription (Expression von Foxo1DN) im Zentralen Nervensystem verändert
die Glukosehomöostase hingegen nicht.
FV75
In vitro Charakterisierung des
Rab-GTPase-aktivierenden Proteins TBC 1D1
Neumann F 1 , Gompert M 2 , Klein HW 2 , Dokas J 1 , Chadt A 1 ,
Joost HG 1 , Al-Hasani H 1
1 Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-
Rehbrücke, Pharmakologie, Nuthetal, Germany; 2 Universität
Köln, Institut für Biochemie, Köln, Germany
Fragestellung: TBC 1D 1 ist nah verwandt mit dem Insulinsignalprotein
AS 160 und ist an der Regulation der insulinstimulierten Glucoseaufnahme
sowie am Fettstoffwechsel im Skelettmuskel beteiligt. Eine humane
Variante (R125W) wird mit extremer familiärer Adipositas assoziiert,
während eine loss-of-function Mutation im schlanken SJL-Mausstamm
protektiv gegen Adipositas und Typ-2-Diabetes wirkt. Die biologische
Aktivität von TBC 1D 1 wird über eine intrinsische Rab-GAP (GTPase
activating protein) Aktivität vermittelt, die durch Serin/Threonin-Phosphorylierung
reguliert wird. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des
molekularen Mechanismus der Regulation der TBC 1D 1-GAP-Aktivität
und die Identifizierung von Rab-Proteinen im TBC 1D 1-Signalweg.
Durch die Etablierung eines in vitro Testverfahrens zur Messung der
enzymatischen Spezifität und Rab-GAP-Aktivität von TBC 1D 1 soll das
Protein funktionell charakterisiert werden. Methodik: Mittels Affymetrix-Chip-Analysen
wurde die mRNA-Expression von 56 Rab-GTPasen im
Skelettmuskel und weißem Fettgewebe von verschiedenen Mausstämmen
quantifiziert. Für die Etablierung eines in vitro Testverfahrens wurden
cDNAs für 8 Rab-GTPasen mit hoher Genexpression im Skelettmuskel
und die 48 kDa GAP-Domäne aus TBC1D 1 sowie eine inaktive Mutante
(R941K) kloniert, in E. coli als GST-Fusionsproteine exprimiert und
mittels GSH-Affinitätschromatografie aufgereinigt. Zusätzlich wurde
Vollängen, Histidin-markiertes TBC 1D 1 (1255 AS; SP-Acc: Q60949)
und die inaktive R941K Punktmutante in Baculoviren generiert, in
Sf9-Insektenzellen exprimiert und über Ni-NTA-Affinitätschromatografie
aufgereinigt. Die GAP-Aktivität von TBC 1D 1 wurde durch Umsatzmessungen
von radioaktiv markiertem GTP bestimmt. Ergebnisse: Die Aufreinigung
der GST-Rabs und GST-GAP-Domäne aus Bakterienlysaten ergab
Ausbeuten von ca. 0,1 mg/l Kultur. Verglichen mit den bislang getesteten
Rabs, zeigte die rekombinante TBC1D 1-GAP-Domäne die
höchste spezifische Aktivität für die im Muskel stark exprimierte Isoform
Rab10. In Anwesenheit der GAP-Domäne wurde die GTPase-Aktivität
von Rab10 um das > 10fache stimuliert. Das His6-markierte 160
kDa TBC 1D 1-Protein wurde in Baculoviren-infizierten Sf9-Zellen exprimiert
und mit hoher Ausbeute (0,3 mg/l Kultur) gereinigt. Erste Versuche
belegten eine katalytische GAP-Aktivität von His6-TBC 1D 1 gegenüber
GST-Rab10 in vitro. Um die Stabilität von His6-TBC 1D 1 zu erhöhen
und die Robustheit des Testverfahrens zu verbessern, müssen die Reinigungs-
und Reaktionsbedingungen jedoch noch weiter optimiert werden.
Auch die Untersuchung weiterer Rabs ist noch offen. Schlussfolgerung:
Die Isoform Rab10 ist potentiell ein primärer Effektor von TBC 1D 1
in der Insulinsignalkaskade des Skelettmuskels. Unser Testverfahren ermöglicht
eine funktionelle in vitro Charakterisierung von TBC 1D 1 und
kann die Suche nach TBC 1D 1-Inhibitoren sowie neuer pharmakologischer
Regulatoren von TBC 1D 1 zur Behandlung von Adipositas ermöglichen.
Unterstützt durch DFG (GRK1208).
FV76
Analyse von TBC 1D1 im Substrat- und
Energiestoffwechsel anhand eines adipösen
Mausmodells
Dokas J 1 , Chadt A 1 , Neumann F 1 , Joost HG 1 , Al-Hasani H 1
1 Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-
Rehbrücke, Pharmakologie, Nuthetal, Germany
Fragestellung: In Kreuzungsexperimenten konnte eine SJL-spezifische
Genvariante von Tbc1d1 identifiziert werden, die einen Adipositas-suppressiven
Effekt aufweist. Diese loss-of-function-Mutation führt in Mäusen
zu einer erhöhten Fettoxidation und in Folge dessen zu einem verminderten
Körpergewicht. In Humanstudien hingegen konnte eine
TBC 1D1-Mutation (R125W) identifiziert werden, die zu extremer Adipositas
führt. TBC 1D 1 weist die stärkste Expression im Skelettmuskel
auf, daneben ist es aber auch in Herz, Pankreas und Hypothalamus
exprimiert. Durch die Charakterisierung von TBC 1D 1-defizienten adipösen
Mäusen sollte der Einfluss dieses Proteins auf die Gewichtsentwicklung
sowie auf den Substratstoffwechsel genauer untersucht werden.
Ferner sollte ein potentieller Einfluss auf die hypothalamische Steuerung
46. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 1. – 4. Juni 2011, Leipzig
der Nahrungsaufnahme ausgeschlossen werden. Methodik: Die inaktive
Variante von Tbc1d1 wurde durch Kreuzung vom schlanken SJL-Stamm
auf die adipöse B6.V-Lep ob /J-Maus übertragen. Über 15 Wochen wurden
Körpergewicht und Zusammensetzung (NMR), Respiratorische Quotient,
Energieumsatz, freiwillige Bewegungsaktivität und die Futteraufnahme
ermittelt. Messungen an intakten isolierten Skelettmuskeln (EDL, Soleus)
mit 2-Desoxy-[1,2- 3 H]Glucose und [1- 14 C]Palmitat dienten der detaillierteren
Untersuchung des Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsels. Ergebnisse:
Das Körpergewicht TBC 1D 1-defizienter B6.SJL-Nob1.10-
Lep ob/ob -Mäuse war in Lebenswoche 15 verglichen mit den Kontrollen
signifikant geringer (45,7 € 0,87 vs. 49,4 € 0,68 g; p = 0,00008), was sich
im Wesentlichen auf eine verminderte Fettmasse zurückführen lässt.
Die indirekte Kaloriemetrie ergab einen erhöhten Energieumsatz (Dunkelphase:
2,63 € 0,03 vs. 2,79 € 0,03 kJ/g Muskelmasse; p = 0,01) sowie
einen verminderten RQ (Dunkelphase: 1,013 € 0,0098 vs. 0,994 € 0,0109;
p = 0,069) bei den TBC 1D 1-defizienten Mäusen. Die Messung der Glucoseaufnahme
und der Fettsäureoxidation zeigte eine veränderte Substratpräferenz:
im oxidativen Soleus-Muskel von SJL ob/ob -Mäusen war
die Palmitatoxidation erhöht (2,3 € 0,25 vs. 3,03 € 0,33 pmol/mg/min;
p = 0,046), während im glykolytischen EDL-Muskel die Insulin-stimulierte
Glucoseaufnahme vermindert war (4,63 € 0,40 vs. 3,26 € 0,19 nmol/
mg/20 min; p = 0,002). Die Bewegungsaktivität sowie die Futteraufnahme
waren bei TBC 1D 1-defizienten Mäusen und den Kontrollen gleich.
Schlussfolgerung: TBC1D 1 steuert die Verwertung von Glucose und
Fett im Skelettmuskel und hat somit eine bedeutende Funktion bei der
Regulierung des Muskelstoffwechsels. Der gewichtssuppressive Effekt
der TBC 1D 1-Deletion lässt sich auf eine erhöhte Fettoxidation im Skelettmuskel
zurückführen, da sich eine neuronale Kontrolle der Futteraufnahme
anhand unserer Daten ausschließen lässt. Eine genaue Aufklärung
der Funktion von TBC 1D 1 kann für eine erfolgreiche Adipositas-
Therapie neue Ansätze liefern. Unterstützt durch DFG (GRK1208) und
DDG (Menarini-Förderung).
FV77
Einfluss der Oxidation kurzkettiger Fettsäuren
auf Körpergewicht und Glucosetoleranz
Schulz N 1 , Scherneck S 1 , Kaiser D 1 , Vogel H 1 ,
Himmelbauer H 2 , Wanders R 3 , Houten S 3 , Kluge R 1 ,
Joost HG 1 , Schürmann A 1
1 Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-
Rehbrücke, Abteilungen Experimentelle Diabetologie und
Pharmakologie, Nuthetal, Germany; 2 Centre for Genomic
Regulation, Barcelona, Spain; 3 Academic Medical Center,
Amsterdam, Netherlands
Fragestellung: Das Metabolische Syndrom stellt ein wachsendes Problem
in den westlichen Industierländern dar und kann bei entsprechend
genetischer Prädisposition zum Typ-2-Diabetes führen. Durch den Vergleich
zweier unterschiedlicher Analysen, einer quantitative trait locus
(QTL)-Analyse im polygenen Mausmodell, der NZO-Maus und einer randomisierten
Mutagenese mittels siRNA im Fadenwurm C.elegans, wurde
das Gen Hadh identifiziert, das für das Enzym 3-Hydroxy Coenzym A
Dehydrogenase (hadh) der b-Oxidation kodiert. In Humanstudien wurden
Mutationen im Hadh-Gen mit Hyperinsulinismus im Kindesalter
assoziiert. Methodik: Zur genaueren Untersuchung von Hadh in vivo,
wurde mittels der gene-trap-Methode ein knockout-Mausmodell
(hadh -/- -Maus) generiert. Untersuchungen bezüglich der Körpergewichtsentwicklung,
Akkumulation von Acylcarnitinen sowie zur Glucose-
und Insulintoleranz wurden in vivo durchgeführt. Zudem wurde an
isolierten Inseln die Glucose-stimulierte Insulinsekretion bestimmt. Ergebnisse:
Die Deletion von hadh mittels gene trap war erfolgreich, was
sich unter anderem in erhöhten Acylcarnitinspiegeln im Plasma und
Urin der knockout-Tiere zeigte. Erhielten die Tiere eine fettreiche Diät,
wiesen die hadh -/- -Mäuse ein signifikant verringertes Körpergewicht im
Vergleich zu ihren hadh +/+ -Geschwistern auf. Dieser Unterschied resultierte
vorrangig aus einer erhöhten Körpertemperatur der hadh -/- -Tiere.
Bezüglich der Futteraufnahme oder Bewegungsaktivität waren keine
Veränderungen im Vergleich zu den hadh +/+ -Tieren zu beobachten. Die
intraperitoneale Gabe von Glucose führte in den hadh -/- -Mäusen zu einer
verschlechterten Glucosetoleranz aufgrund verringerter Insulinspiegel
im Plasma. Im Gegensatz dazu wurden im Insulintoleranztest keine
Unterschiede zwischen den Genotypen gemessen. In vitro blieb die Glucose-stimulierte
Insulinsekretion auch durch das Fehlen von hadh unverändert.
Schlussfolgerung: Hadh als Enzym der b-Oxidation scheint
in die Thermoregulation und damit in die Regulation des Körpergewichts
eingebunden zu sein. Desweiteren bewirkt diese Veränderung
der b-Oxidation in vivo eine verschlechterte Glucosehomöostase, die
& Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt! &
Diabetologie & Stoffwechsel 2011; 6: S1–S103
S31