m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

5 Einfluss von Glucoseaufnahmesystemen auf die Produktion
lanz konnte geschlossen werden, was bedeutete, dass alle Stoffwechselprodukte erfasst
wurden.
• Eine technische Verbesserung der Online-Glucosemessung wurde durch Verwendung
des Process Trace Systems mit Probenahme über eine Dialysesonde anstelle des Systems
mit Filtrationsumlauf und OLGA erreicht. Ein Ausfallen des L-Phenylalanins
sowie Störungen durch Luftblasen traten bei diesem System nicht auf. Durch Optimierung
der Parameter von Kalman-Filter und MV3-Regler wurde die Regelung auf
5±0,5 g/l verbessert.
• Mit dem PTS(-)-Stamm 20pMK12 wurden bei einer Glucosekonzentration von 5 g/l
171 mmol/l L-Phenylalanin produziert. Untersuchungen zum Einfluss der Glucosekonzentration
auf die L-Phenylalanin-Produktion mit dem Stamm 20pMK12 ergaben,
dass für die Produktion eine Mindestkonzentration oberhalb des Km-Wertes von
4,1 mmol/l notwendig war. Die Produktion bei 5 g/l oder 30 g/l war ähnlich. Acetat
wurde kaum gebildet. Im Gegensatz zur Produktion mit dem PTS(+)-Stamm 4pF81
war kein Überschussstoffwechsel festzustellen, was auf eine geringere Glucoseaufnahmekapazität
des Systems aus Glucose-Facilitator und E. coli-eigener Glucokinase
hinwies.
• Im kleineren Maßstab (≈2 l) mit vereinfachter Prozessführung wurde gezeigt,
dass die Produktion mit dem PTS(-)-Stamm E. coli 20pMK12 durch eine IPTG-
Konzentration von 25 µmol/l anstelle von 10 µmol/l verbessert werden konnte.
• Die Verwendung des PTS(-)-Stamms 20pMK12 führte im Vergleich zu PTS(+)-
Stämmen nicht zu verbesserter L-Phenylalanin-Produktion, obwohl die Bereitstellung
von PEP verbessert sein sollte. Über die Gründe können nur Vermutungen angestellt
werden. Eine zu starke Belastung der Zellen durch das heterologe System und
die Ausschaltung des Phosphotransferase-Systems, eine zu geringe Induktorkonzentration,
eine Energielimitierung oder eine unzureichende Bereitstellung des zweiten
Vorläufermetaboliten E4P waren denkbar.
• Die maximalen differentiellen L-Phenylalanin-Glucose-Selektivitäten bei dem
PTS(+)-Stamm und bei dem PTS(-)-Stamm lagen mit 20,8 mol/mol % bzw.
18,5 mol/mol % deutlich unterhalb der theoretisch maximal möglichen Werte. Um
sich diesen anzunähern müssten weitere genetische Veränderungen an den Stämmen
vorgenommen werden.
Die L-Phenylalanin-Produktion mit dem in dieser Arbeit zur Verfügung stehenden
Stamm mit heterologem Glucoseaufnahmesystem war gegenüber dem Stamm mit Glucoseaufnahme
über das Phosphotransferase-System nicht verbessert. Daher wurde der PTS(+)-
Stamm 4pF81 für die weitere Prozessentwicklung verwendet.
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