m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

4.3 Fermentationen im Zulaufverfahren im 20 l Bioreaktor
L-Tyrosin Abgas
Glucose
Ammoniak
Zuluft
pH
QIC
pO2 QIC
M
Glucose
QIC
Bioreaktor
QIR QIR
O2 CO2 Dialysesonde
LABVIEW
MEDUSA
Prozesskontrollsystem
Abb. 4.9: Schematische Darstellung des Fermentationsprozesses im 20 l Bioreaktor mit
Peripherie, mit Dialysesonde zur Glucosemessung (Geräteliste, siehe Abschnitt A.2.9)
Das vorgelegte Fermentationsmedium (6,75 l) wurde mit 10 % (v/v) Vorkultur beimpft,
so dass 7,5 l erreicht wurden. Der Zuluftvolumenstrom betrug 2,5 l/min, die Drehzahl
400 Upm und der Druck 0,2 bar. Um den zunehmendem Sauerstoffbedarf der Zellen zu decken,
wurde die Zuluft während der Wachstumsphase manuell bis maximal 12 l/min erhöht
und ein Überdruck von bis zu 0,5 bar eingestellt. Über die Drehzahl mit einem Maximalwert
von 1600 Upm wurde die Gelöstsauerstoffkonzentration auf 40 % geregelt, bzw. bei manueller
Einstellung in den ersten Fermentationen auf >40 % eingestellt. Bei Erreichen einer
OD620 = 8 − 12 nach ungefähr 6–7 Stunden wurde die L-Phenylalanin-Produktion durch
Zugabe von 100 µmol/l IPTG bei PTS(+)-Stämmen, bzw. die bei den jeweiligen Experimenten
angegebene Konzentration induziert. Eine Induktion mit 100 µmol/l IPTG war für
PTS(+)-Stämme am besten geeignet [Gerigk 2001]. Nach 6–8 Stunden (OD620 = 12 − 15)
waren die vorgelegten Substratmengen an Glucose (15 g/l) und L-Tyrosin (0,3 g/l) soweit
aufgebraucht, dass die Zufuhr der Substrate gestartet wurde. Die Dosiereinheiten für Glucose
und L-Tyrosin bestanden jeweils aus Waage, Dosierstrecke und Schlauchpumpe. Die
Glucoselösung hatte eine Konzentration von 700 g/l, die L-Tyrosin-Lösung eine Konzentration
von 25 g/l in 5 %iger Ammoniaklösung. In der Wachstumsphase wurde ein festgelegtes
L-Tyrosin-Volumen von ≈170 ml geregelt zugegeben (L-Tyrosin-Zufuhr, siehe Abschnitt
4.3.6). Damit wurde eine OD620 = 80 erreicht. Danach wurde die L-Tyrosin-Zufuhr
auf ein Minimum von 100 mg/h reduziert, ausreichend für den Erhaltungsstoffwechsel. Damit
erfolgte kein weiteres Wachstum. Glucose wurde auf einen Sollwert von 5 g/l, bzw.
den bei den jeweiligen Experimenten angegebenen Wert geregelt (siehe Abschnitt 4.3.5).
Eine zweite Induktion mit gleicher Induktorkonzentration wie bei der ersten Induktion
erfolgte nach 28-30 Stunden. Antischaum wurde bei Bedarf manuell über eine Schlauchpumpe
zudosiert. Probenahmen erfolgten über die Fermentationsdauer im Abstand von
1,5–2 Stunden. Die durchgeführte Offline Analytik beinhaltete die Messung von Glucose,
optischer Dichte, Biotrockenmasse, Plasmidstabilität, mikroskopische Aufnahmen und
HPLC-Analysen zur Bestimmung von Aminosäuren, Ammonium und organischen Säuren.
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