m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich
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3 Stand des Wissens<br />
tion festgestellt, allerdings bei verdoppelter Generationszeit unter Supplementierung mit<br />
C4-Verbindungen. Die PEP-Verfügbarkeit konnte darüber hinaus durch Einbringen der Pyruvatcarboxylase<br />
aus Corynebacterium glutamicum erhöht werden [Anderlei 2002]. Durch<br />
eine Überexpression der Transketolase und der PEP-Carboxykinase bei Wachstum auf<br />
Glucose und Succinat konnte die DHS-Produktion verbessert werden [Li und Frost 1999b].<br />
Systeme zur Gen-Expression<br />
Die Expression von zelleigenen oder heterologen Genen kann chromosomal oder über Plasmidsysteme<br />
erfolgen. Vorteil der chromosomalen Integration ist die Stabilität des Genproduktes<br />
[Snell u. a. 1996]. Die Expression kann allerdings selbst unter Kontrolle eines starken<br />
Promotors unzureichend sein [Kreutzer 2000]. Eine stärkere Expression kann durch<br />
Verwendung von Plasmidsystemen mit höherer Kopienzahl und einem starken Promotor<br />
erreicht werden [Berry 1996]. Der Zeitpunkt der Expression kann durch Verwendung<br />
eines induzierbaren Promotors beeinflusst werden. Der starke Ptac-Promotor ist durch<br />
1-Isopropyl-ß-thiogalactosid (IPTG) induzierbar und nicht durch Glucose reguliert 3 . IPTG,<br />
ein Galactosid, wird nicht von dem Enzym ß-Galactosidase gespalten und demzufolge nicht<br />
verstoffwechselt, wodurch ein konstantes Induktionsniveau sichergestellt wird. Bei einem<br />
Einsatz in der fermentativen Produktion zur Expression heterologer Proteine ist die Induktorkonzentration<br />
und die Art der Zugabe wichtig [Altenbach-Rehm 2000]. Der Einfluss<br />
der Induktion ist dabei vom biologischen System und dem Stress, der durch die Fremdproteinproduktion<br />
auf den Zellstoffwechsel ausgeübt wird, abhängig. Das Wachstum wird<br />
durch IPTG reduziert. IPTG-Konzentrationen über 4 mmol/l sind toxisch für die Zellen<br />
und führen zu Plasmidinstabilität, zum verfrühten Übergang in die stationäre Phase oder<br />
sogar zum Absterben der Zellen [Donovan u. a. 1996].<br />
3.2 Bioprozessentwicklung<br />
3.2.1 Bioreaktoren<br />
Bioreaktoren dienen als Reaktionsgefäße zur Kultivierung von Biokatalysatoren unter definierten<br />
Bedingungen. Es werden verschiedene Arten von Reaktoren unterschieden. In<br />
Oberflächenreaktoren ist die Biomasse an einen festen Träger gebunden oder schwimmt an<br />
der Oberfläche. Weiter verbreitet ist die Submerskultur, bei der die Zellen suspendiert in<br />
flüssigem Nährmedium vorliegen. Das Nährmedium wird durchmischt. Die zu kultivierenden<br />
Zellen werden in aerober Kultur mit Sauerstoff versorgt und gasförmige Stoffwechselprodukte<br />
abgeführt. Eine weitere Klassifizierung der Reaktoren erfolgt nach Energieeintrag<br />
und Strömungsführung [Schuegerl und Bellgardt 2000]. Es gibt Rührkessel, Schlaufen- und<br />
3 Der Ptac-Promotor leitet sich aus dem Plac-Promotor ab. Bei diesem wird die Transkription durch<br />
Katabolit-Repression gesteuert. Die Lac-Gene zur Verstoffwechslung von Lactose sind in Anwesenheit<br />
von Glucose inaktiv. In Abwesenheit von Glucose steigt der cAMP-Spiegel. cAMP bindet an das CAP-<br />
Protein, das an die DNA bindet, wodurch die Affinität der RNA-Polymerase zum Promotor erhöht<br />
wird und eine Expression erfolgt (positive Kontrolle). Bei beiden Systemen wird der Repressor der<br />
Genexpression durch das Gen lacI hergestellt. Dieser bindet an die DNA. IPTG bindet wie Lactose an<br />
den Repressor zur Aufhebung der Repression.<br />
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