m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

A Anhang
Plasmidstabilität
Die Plasmidstabilität wurde bei Fermentationen regelmäßig überprüft. Dazu wurden die
Proben mit 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt (10 −5 –10 −8 , abhängig von der optischen Dichte).
Von mindestens zwei Verdünnungen wurden je 100 µl auf LB-Platten mit und ohne Ampicillin
als Selektionsmarker für Plasmide enthaltende Zellen ausgestrichen, über Nacht bei
37 ◦ C inkubiert und die Kolonien gezählt. Aus dem Verhältnis der Koloniezahlen auf den
Platten mit und ohne Ampicillin wurde der Anteil an Zellen mit Plasmiden bestimmt.
Aminosäuren
Die Konzentrationen der Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Alanin und
L-Glutamat sowie von Ammonium wurden mittels Reversed-Phase-HPLC (High Pressure
Liquid Chromatography) bestimmt. Vor der Messung wurden die Proben entsprechend des
linearen Messbereichs der HPLC von 10 bis 600 µM verdünnt. Eine Vorsäulenderivatisierung
der Proben erfolgte mit ortho-Phtaldialdehyd und Mercaptoethanol. Im alkalischen
reagieren primäre Amine zu stark fluoreszierenden Isoindolen. Nach Gradientenelution
(siehe Abschnitt A.2.4) wurden die Substanzen mit einem Fluoreszenzsensor gemessen.
Die Auswertung der Peakflächen erfolgte mittels der Software Chromeleon.
Organische Säuren
Die Konzentrationen der organischen Säuren Acetat, DAH, Shikimat, 3-DHS, Lactat, Fumarat,
Pyruvat, Uracil und Orotsäure wurden mittels Ionenausschluss-HPLC bestimmt.
Die Detektion erfolgte spektrophotometrisch durch einen UV-Detektor bei einer Wellenlänge
von λ=215 nm. Die Proben wurden dem linearen Messbereich von 0,001–2,0 mM
entsprechend verdünnt. Die Auswertung der Peakflächen erfolgte mittels der Software
Chromeleon.
1 H-NMR
Die 1 H-NMR-Messungen wurden mit einem mit Puls-Fourier-Transform-Technik ausgestatteten
NMR-Spektrometer mit einer Betriebsfrequenz von 300 MHz durchgeführt. Zur Vorbereitung
wurden 400 µl Probe zwei Stunden in der Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend
in 800 µl 4 mM 3-Trimethyl-Silyl-Propion-2,2,3,3-d-säure (TSP) in D2O gelöst.
TSP wurde als Referenzverbindung zur Quantifizierung zugegeben. Das Singulett-Signal
entsprach neun Protonen. Zur Quantifizierung wurde die Fläche unter dem Signal verwendet.
Die Nachweisgrenze lag bei ungefähr 0,5–1,0 g/l (siehe [Zaja 2001]).
A.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration in Lösungen wurde nach der Methode von Bradford bestimmt
[Bradford 1976], die auf einer ionischen Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue an
die basischen Aminogruppen der Proteine beruht, wodurch das Absorptionsmaximum des
Farbstoffs verschoben wird. Die mit Rinderserumalbumin erstellte Kalibriergerade war im
Bereich von 25–300 mg/l linear. Zur Messung wurden 50 µl Probe in 950 µl Bradfordreagenz
gegeben und inkubiert. Bei einer Wellenlänge von λ=595 nm wurde die Absorption und
damit der Proteingehalt photometrisch (Ultrospec 3000 pro) gemessen.
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