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3.1 Biologische Grundlagen Über den oxidativen Pentosephosphatweg werden Hexosephosphate und Pentosephosphate ineinander umgewandelt. Reduktionsäquivalente (NADPH) und Pentosen für die Biosynthese, wie das für die Nucleotidsynthese wichtige Ribose-5-Phosphat werden gebildet. Zudem entsteht Erythrose-4-Phosphat, das für die Synthese aromatischer Metabolite verwendet wird. Unter anaeroben Bedingungen ist kein Sauerstoff als Elektronenakzeptor vorhanden. E. coli gewinnt unter diesen Bedingungen Energie durch gemischte Säuregärung. Die Spaltprodukte der Glucose dienen dabei zugleich als Elektronendonatoren und -akzeptoren. Aus Pyruvat werden Lactat und Formiat gebildet. Formiat wird zu Kohlendioxid und Wasserstoff umgewandelt. Acetyl-CoA wird zu Acetat und Ethanol metabolisiert. Bei der Bildung von Acetat entsteht ATP. Aus Phosphoenolpyruvat wird Succinat gebildet [Boeck und Sawers 1996]. Pro mol Glucose werden nur 1–4 mol ATP gebildet. Um ausreichend Energie zu gewinnen, muss daher mehr Substrat umgesetzt werden als bei aerobem Stoffwechsel [Schlegel 1992]. Auch unter aeroben Bedingungen und dabei hohen Glucosekonzentrationen kann Acetat gebildet werden. Die aerobe Acetatbildung wird als Glucose-Überschussstoffwechsel oder bakterieller Crabtree-Effekt bezeichnet. Abbauprodukte aus der Glycolyse akkumulieren. Acetyl-CoA wird über Acetyl-Phosphat zu Acetat umgesetzt. Der Überschussstoffwechsel kann auch als Ungleichgewicht zwischen Substrataufnahme und dem Bedarf der Zelle für Biosynthese und Energieproduktion beschrieben werden [Holms 1996]. Durch die Acetatbildung wird Energie gewonnen. Pro mol Acetat wird ein mol ATP gebildet [Ko u. a. 1993]. Damit könnte der Zelle eine zusätzliche Möglichkeit zur ATP- Gewinnung zur Verfügung stehen, wenn die respiratorische Kapazität der Zelle erschöpft ist [Andersen und von Meyenburg 1980]. Die aerobe Acetatproduktion inhibiert jedoch Wachstum und Proteinproduktion [Luli und Strohl 1990], [Shimizu u. a. 1988]. Eine Reduzierung der Acetatbildung kann durch genetische Veränderungen der Zellen erreicht werden. So wurde bei Zellen mit inaktivem PT-System keine Acetatproduktion beobachtet, jedoch war die Wachstumsrate gleichzeitig um 50 % reduziert [Ponce u. a. 1998]. Daneben kann eine Reduzierung der aeroben Acetatbildung durch die Erhöhung der anaplerotischen Flüsse erreicht werden [Farmer und Liao 1997]. Aromatenbiosynthese Die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan werden über den Aromatenbiosyntheseweg gebildet, der in Abb. 3.4 dargestellt ist. Phosphoenolpyruvat (PEP) aus der Glycolyse und Erythrose-4-Phosphat (E4P) aus dem Pentosephosphatweg werden in der Eingangsreaktion des Aromatenbiosyntheseweges durch drei Isoenzyme der 3-Desoxy-D-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat-Synthase (DAHP-Synthase) zu DAHP kondensiert. Daraus entsteht über Shikimat und mehrere Zwischenschritte unter Einbau eines zweiten PEP-Moleküls Chorismat. Aus Chorismat wird über Anthranilat in mehreren Schritten L-Tryptophan gebildet. L-Tyrosin und L-Phenylalanin werden über Prephenat und Phenylpyruvat, bzw. 4-Hydroxyphenylpyruvat aus Chorismat gebildet. Neben den aromatischen Aminosäuren werden Ausgangsmetabolite für die Synthese von para- Aminobenzoesäure, Folsäure, Menachinon und weiterer Metabolite gebildet [Pittard 1996]. 11
3 Stand des Wissens L-Tryptophan Phosphoenolpyruvat Erythrose-4-Phosphat Pi DAHP-Synthase aroF aroG aroH 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-Phosphat Dehydroquinat (DHQ) 3-Dehydroshikimat (DHS) NADPH NADP Phosphoenolpyruvat COOH H2N H CH2 N H P i H O 2 ATP Shikimat Shikimat-3-Phosphat 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat (EPSP) P i H2O CO Glutamat �-Ketoglutarat 2 Prephenat 3-DHQ-Synthase aroB Shikimat-Dehydrogenase aroE Shikimatkinase I, II aroK aroL 5-Enolpyruvyl-3-Phosphat-Synthase Chorismat-Synthase aroC Chorismat Chorismat-Mutase Chorismat-Mutase Prephenat-Dehydratase Prephenat-Dehydrogenase pheA tyrA Phenylpyruvat L-Phenylalanin COOH H2N H CH2 Chorismat-Mutase Prephenat-Dehydratase pheA Aminotransferase tyrB 3-DHQ-Dehydratase aroD aroA CO 2 4-Hydroxyphenylpyruvat Glutamat �-Ketoglutarat Prephenat Chorismat-Mutase Prephenat-Dehydrogenase tyrA Aminotransferase tyrB L-Tyrosin COOH H2N H CH2 Abb. 3.4: Schema des Aromatenbiosyntheseweges in Escherichia coli mit den aromatischen Aminosäuren L-Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Tyrosin 12 OH
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4 Produktionsorganismen, apparative
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5 Einfluss von Glucoseaufnahmesyste
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6 Einfluss verschiedener Fermentati
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7 Integration der Reaktivextraktion
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8 Zusammenfassung des Systems aus G
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8 Zusammenfassung In den ersten 20
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9 Ausblick ein vielversprechendes W
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A Anhang Accutrend � Sensors war
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A Anhang Um die Experimente besser
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A Anhang pH-Wert dieses gepufferten
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A Anhang Lösungen für die Reaktiv
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A Anhang A.2.5 Geräteparameter der
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A Anhang Gerät Typ Hersteller pH-E
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A Anhang Plasmidstabilität Die Pla
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A Anhang A.3.8 GC-Analytik Die Best
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A Anhang 164
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Literaturverzeichnis [Bailey 1991]
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Literaturverzeichnis [Diaz u. a. 20
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Literaturverzeichnis [Gibson u. a.
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Literaturverzeichnis [Kole u. a. 19
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