m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

3 Stand des Wissens
Neben der DAHP-Synthase AroF wird auch die Shikimatkinase AroL durch L-Tyrosin
über Aktivierung des Regulatorproteins TyrR inhibiert. Eine Inhibierung durch L-Tyrosin
kann einerseits durch Herstellung eines gegen Inhibierung resistenten Stammes verhindert
werden. Andererseits kann eine Inhibierung durch L-Tyrosin durch prozesstechnische
Maßnahmen vermieden werden. Bei Einsatz eines L-Tyrosin-auxotrophen L-Phenylalanin-
Produzenten zur L-Phenylalanin-Produktion kann die L-Tyrosin-Zufuhr limitiert werden,
so dass kein L-Tyrosin akkumuliert. Über eine Limitierung kann zudem die Wachstumsrate
gesteuert werden. Wachstums- und Produktionsphase können dadurch voneinander
getrennt werden. Die Limitierung durch L-Tyrosin ist entscheidend für Selektivität und
Produktbildungsrate [Foerberg u. a. 1988], [Hwang u. a. 1985].
Wie die L-Tyrosin-Konzentration ist auch die Glucosekonzentration ein entscheidender
Parameter bei der L-Phenylalanin-Produktion. Das bei Überschussmetabolismus gebildete
Acetat inhibiert Wachstum und Produktion. Bereits Glucosekonzentrationen unter 1 g/l
können zum Crabtree-Effekt führen [Luli und Strohl 1990]. Bei 1-8 g/l Acetat wird die
Wachstumsrate verringert [Xu u. a. 1999b]. Die Acetatbildung kann durch genetische
Veränderungen der Stämme oder Änderungen der Kultivierungsbedingungen minimiert
werden [Lee 1996], [Riesenberg und Guthke 1999]. Die Glucoseaufnahmerate und der Fluss
von Pyruvat in den TCA-Zyklus und die Atmung sind die sensitivsten Parameter bei der
Kontrolle des Ausmaßes der Acetatbildung. So produzierten Stämme mit überexprimierter
PEP-Synthase und DAHP-Synthase AroG in Schüttelkolben kaum Acetat. Auch durch
einen größeren Fluß durch die PEP-Carboxylase und einen deregulierten Glyoxylatweg
und damit verstärkten Fluss in anaplerotische Stoffwechselwege konnte die Acetatproduktion
verringert werden [Farmer und Liao 1997]. Eingriffe in den Zentralstoffwechsel zur
Reduzierung der Acetatbildung können jedoch weitergehende, unerwünschte Einflüsse auf
den gesamten Stoffwechsel haben.
Daher bieten sich prozesstechnische Ansätze zur Minimierung der Acetatbildung
an. Insbesondere bei der Produktion in großen Reaktoren mit Gradientenbildung ist
die Regelung oder Steuerung der Glucose zur Vermeidung von Acetat entscheidend
[Holms 1996, van de Walle und Shiloach 1998, Axe und Bailey 1995]. Hohe Glucosekonzentrationen
führen in großen Reaktoren zu sauerstofflimitierten Bereichen, in denen
Acetat gebildet und dadurch die Selektivität verringert wird [Xu u. a. 1999a]. Bei geeigneter
Prozessführung kann über eine Kontrolle der Glucose-Zufuhr und der Gelöstsauerstoffkonzentration
eine Acetatbildung verringert werden [Konstantinov u. a. 1991],
[Konstantinov und Yoshida 1992], [Akesson u. a. 2001]. Zur Regelung der Glucosekonzentration
wurden Ansätze unter Verwendung empirischer Zusammenhänge oder
parameteradaptiver Regler und Online-Messung der Glucosekonzentration im Bioreaktor
eingesetzt [Hitzmann u. a. 2000], [Kelle u. a. 1996], [Mulchandani und Basse 1995],
[Luli und Strohl 1990], [Kleman u. a. 1991a], [Kleman u. a. 1991b]. Dabei muss die Glucose
zur Vermeidung von Acetatbildung niedrig gehalten werden. Gleichzeitig muss sie
ausreichend hoch sein, um Wachstums- und Produktbildungsraten aufrecht zu erhalten
[Akesson u. a. 2001]. Da die Glucoseaufnahmerate in einem Prozess im Zulaufverfahren
mit der Prozessdauer abnimmt [Lin u. a. 2001], ist eine Anpassung der Glucosezufuhr
notwendig, z.B. über einen vorausschauenden und rückwirkendenden (Predictive and
Feedback) Regelalgorithmus [Kleman u. a. 1991a], [Kleman u. a. 1991b].
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