m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

5 Einfluss von Glucoseaufnahmesystemen auf die Produktion
auf L-Tyrosin-Limitierung am Ende der Wachstumsphase nahm die Konzentration von
Shikimat-3-Phosphat jedoch schnell ab. Stattdessen war Shikimat nachweisbar, dessen
Konzentration im weiteren Verlauf konstant blieb. Eine Abnahme hätte bedeutet, dass
es metabolisiert wurde. Mittels einer Dephosphorylierungsreaktion konnte nachgewiesen
werden, dass die Konzentration von Shikimat-3-Phosphat am Ende der Wachstumsphase
ungefähr der Shikimatkonzentration entsprach. Eine mögliche Erklärung war, dass Shikimat
nach der Umstellung im Stoffwechsel durch intra- oder extrazelluläre Dephosphorylierung
aus Shikimat-3-Phosphat entstand [Oldiges 2003]. Genaue Mechanismen sind unbekannt,
aber einen Einfluss könnte das bei der Dephosphorylierung frei werdende ATP
haben. Die Nachweisbarkeit von Shikimat-3-Phosphat bedeutete in jedem Fall, dass in
der Wachstumsphase entweder nicht ausreichend Phosphoenolpyruvat für die Bildung von
5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat (EPSP) vorhanden war oder dass die chromosomale
Expression der EPSP-Synthase (AroA) zu schwach war. Während der reinen Produktionsphase
war weder Shikimat-3-Phosphat nachweisbar, noch war eine Zunahme an Shikimat
festzustellen. Das bedeutete, dass entweder der Fluss durch die Aromatenbiosynthese aufgrund
der Wachstumslimitierung geringer war, und somit keine Anhäufung mehr stattfand
oder dass Phosphoenolpyruvat, das während des Wachstums für den Tricarbonsäure-
Zyklus benötigt wurde, nicht mehr limitierend war. Das extrazellulär nachweisbare Shikimat
wurde jedoch nicht von den Zellen abgebaut. 3-Dehydroshikimat akkumulierte wahrscheinlich,
da die Shikimatdehydrogenase (AroE) durch Shikimat Feedback inhibiert wird
[Dell und Frost 1993]. Durch eine Überexpression von AroE könnte die Limitierung aufgehoben
werden. Da das Enzym auch die Reaktion von Dehydroquinat zu Chinasäure katalysiert,
würde allerdings auch der Fluss in diese Richtung zunehmen [Chandran u. a. 2003].
Genauere Untersuchungen zum Aromatenbiosyntheseweg wurden von Oldiges durchgeführt
[Oldiges 2003].
5.1.2 Kohlenstoffbilanz
Die Verteilung des umgesetzten Kohlenstoffs während der Fermentation zur
L-Phenylalanin-Produktion wurde durch Berechnung der integralen molaren Kohlenstoffmengen
der Produkte bestimmt. Die Kohlenstoffanteile der einzelnen Produkte
sind in Abb. 5.3 in Prozent des in Form von Glucose und L-Tyrosin zugeführten
Kohlenstoffs angegeben. Die Nebenprodukte Pyruvat, Alanin, Orotsäure, Uracil und
Glutamat sind nicht aufgetragen, da deren Anteil summiert bei nur maximal 0,5 C-mol %
lag. Der Kohlenstoffanteil aus der Biomasse wurde mittels einer empirischen Annahme
der Biomassezusammensetzung (CH1,83N0,22O0,5 [Nielsen und Villadsen 1994]) aus der
Biotrockenmasse berechnet.
Aus dieser Bilanz war zu entnehmen, dass die Hälfte des eingesetzten Kohlenstoffs in
Kohlendioxid umgewandelt wurde. Während der Produktionsphase erfolgte eine leichte
Zunahme. Die Biomasse machte in der Produktionsphase 12-20 % aus. Der Anteil an
L-Phenylalanin lag zwischen 20 und 26 % und nahm gegen Ende leicht ab, während der
Acetatanteil bis auf 9 % zunahm. Shikimat und 3-Dehydroshikimat hatten nur einen sehr
geringen Anteil von ungefähr 1 %.
Die Wachstumsphase bis t = 14 h ist schraffiert dargestellt, da die Kohlenstoffbilanz
in diesem Bereich relativ ungenau war. Insbesondere die Bestimmung der Biomasse war
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