m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

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Int. Y L-Phe/Gluc [mol/mol %] 16 12 8 4 0 t Prozess =13,5 h 10 25 IPTG [µM] 50 5.3 Vergleich der Produktion mit verschiedenen Stämmen Int. Y L-Phe/Gluc [mol/mol %] 16 12 8 4 0 t Prozess =49,5 h 10 25 IPTG [µM] 50 Abb. 5.11: Integrale L-Phenylalanin-Glucose-Selektivität nach 13,5 und 49,5 Prozessstunden bei Fermentationen im Sixfors vario bei unterschiedlichen Induktorkonzentrationen (E. <strong>coli</strong> 20pMK12) Die integrale L-Phenylalanin-Glucose-Selektivität war am Anfang der Produktionsphase nach 13,5 Stunden mit ≈5,5 mol/mol % bei allen Fermentationen ungefähr gleich. Am Ende der Fermentationen lag die integrale Selektivität mit 15,7 % bei 25 µmol/l IPTG am höchsten. Bei Induktion mit 50 µmol/l IPTG lag sie bei 13,6 % und bei 10 µmol/l IPTG bei 11,4 % (siehe Abb. 5.11). Obwohl die maximal erreichte optische Dichte mit zunehmender IPTG-Konzentration stärker beeinträchtigt wurde, wurden bei einer Induktorkonzentration von 25 µmol/l die höchste L-Phenylalanin-Konzentration und Selektivät erreicht. Das konnte darin begründet liegen, dass die Gene zur L-Phenylalanin-Produktion bei niedrigerer Induktor-Konzentration nicht ausreichend exprimiert wurden. Bei höherer Induktor-Konzentration hingegen wirkte sich die hohe Expression des Glucose-Facilitators, eines heterologen Proteins, auf Dauer möglicherweise negativ auf den Stoffwechsel der Zellen und damit die Produktbildung aus [Neubauer u. a. 2003]. Eine verbesserte Produktion konnte diesen Ergebnissen zufolge mit einer Induktorkonzentration von 25 µmol/l erreicht werden. Zur weitergehenden Untersuchung des Einflusses der Induktion wären entsprechende Versuche im 20 l Bioreaktor unter definierten Bedingungen notwenig, die im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt wurden, da der PTS(-)-Stamm nicht für die weitere Prozessentwicklung verwendet wurde (vgl. Abschnitt 5.3). 5.3 Vergleich der Produktion mit verschiedenen Stämmen In den Abschnitten 5.1 und 5.2 wurden Untersuchungen mit dem PTS(+)-Stamm 4pF81 und dem PTS(-)-Stamm 20pMK12 vorgestellt. Diese Stämme unterschieden sich außer in dem System zur Glucoseaufnahme auch in der Expression von Genen des Aromatenbiosyntheseweges. Die genetischen Veränderungen der Stämme sind in Abb. 5.12 dargestellt. Zusätzlich ist der PTS(+)-Stamm 4pF20 abgebildet. Die L-Phenylalanin-Produktion mit diesem PTS(+)-Stamm mit Veränderungen im Aromatenbiosyntheseweg, vergleichbar mit denen des Stamms 20pMK12, wurde von Gerigk [Gerigk 2001] untersucht. Bei diesem Stamm wurden wie bei dem Stamm 20pMK12 nur die Chorismatmutase/Prephenatdehydratase und die DAHP-Synthase plasmidkodiert exprimiert. In beiden 81
5 Einfluss von Glucoseaufnahmesystemen auf die Produktion Aromatenbiosyntheseweg PEP Glucose PTS DAHP 3-Dehydroshikimat Shikimate EPSP aroF 3-Dehydroquinat E4P Shikimate-3-Phosphat Chorismat tyrA L-Tyrosin Prephenat pheA pheA* Prephenat pheA pheA* Prephenat pheA Phenylpyruvat pheA Phenylpyruvat pheA pheA* Phenylpyruvat pheA L-Phenylalanin aroF aroB aroL pheA* PEP Glucose PTS DAHP 3-Dehydroshikimat Shikimate EPSP aroF 3-Dehydroquinat E4P Shikimate-3-Phosphat Chorismat tyrA L-Phenylalanin aroF* L-Tyrosin PEP Glucose PTS DAHP 3-Dehydroshikimat Shikimate EPSP aroF 3-Dehydroquinat E4P Shikimate-3-Phosphat Chorismat tyrA L-Phenylalanin 4pF81 4pF20 20pMK12 glf aroF* L-Tyrosin pheA* pheA* Abb. 5.12: Genetische Veränderungen in den Stämmen E. <strong>coli</strong> 4pF81 (PTS(+)), 4pF20 (PTS(+)) und 20pMK12 (PTS(-)); angegeben sind nur die veränderten Gene, die plasmidkodierten Gene sind jeweils rechts dargestellt; * steht für Resistenz gegen Feedback- Inhibierung durch L-Tyrosin (aroF* ) oder L-Phenylalanin (pheA* ) Stämmen wurde im Gegensatz zu dem Stamm 4pF81, bei dem die Wildtyp-DAHP- Synthase exprimiert wurde, AroF*, eine gegen Feedback-Inhibierung durch L-Tyrosin resistente Variante, überexprimiert. Da diese DAHP-Synthase inaktiver und instabiler als der Wildtyp war und Inclusion bodies bildete, waren Stämme mit dem Wildtyp besser geeignet, vorausgesetzt, dass die Prozessstrategie der L-Tyrosin-Limitierung zur Vermeidung einer L-Tyrosin-Inhibierung eingesetzt wurde [Gerigk 2001]. Da die Dehydroquinatsynthase (AroB) und die Shikimatkinase II (AroL) in den Stämmen 20pMK12 und 4pF20 nicht überexprimiert wurden, war die Bildung von DAH(P) und Shikimat, sowie 3-Dehydroshikimat festzustellen. Bei dem Stamm 4pF81 wurden nur geringe Mengen Shikimat und 3-Dehydroshikimat nachgewiesen. Für die Untersuchungen stand kein PTS(-)-Stamm mit weitergehenden Veränderungen im Aromatenbiosyntheseweg zur Verfügung. Die Stämme 4pF81 und 20pMK12 wurden trotz ihrer Unterschiede in den Veränderungen im Aromatenbiosyntheseweg grundlegend verglichen, um Tendenzen aufzuzeigen. Die Daten des PTS(+)-Stamms 4pF20 wurden zum Vergleich herangezogen. 5.3.1 Einfluss der Glucosekonzentration Ein Vergleich zum Einfluss der Glucosekonzentration auf die L-Phenylalanin-Produktion zeigt unabhängig von den Veränderungen im Aromatenbiosyntheseweg deutliche Unterschiede zwischen dem PTS(+) und dem PTS(-)-Stamm. Bei Stämmen mit Glucoseaufnahme über das Phosphotransferase-System führte ein hoher Glucoseüberschuss zu 82
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