m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

5.3 Vergleich der Produktion mit verschiedenen Stämmen
Die Glucoseaufnahme über den Glucose-Facilitator ist vom Substratgradienten
abhängig. Bei 30 g/l Glucose war ein höherer Substratgradient anzunehmen als bei
5 g/L und tatsächlich wurde mehr Glucose aufgenommen (vgl. Abschnitt 5.2.1). Dies
würde eher für eine ausreichende Expression des Glucose-Facilitators sprechen. Dagegen
war denkbar, dass der für die Glucoseaufnahme notwendige hohe Substratgradient bei
nur 5 g/l Glucose im Medium nicht aufrecht erhalten wurde, weil die Glucose nach der
Aufnahme in der Zelle nicht vollständig weiter umgesetzt wurde [Weisser 1996]. Eine
Limitierung durch die Glucokinase, die die Bildung von Glucose-6-Phosphat aus Glucose
katalysierte, war möglich. Die Expression der Glucokinase von E. coli ist relativ schwach
[Curtis und Epstein 1975]. Eine solche Limitierung könnte durch Überexpression des Gens
der Glucokinase aufgehoben werden. Allerdings führt die Überexpression des Gens glk
zu einer starken Belastung der Zellen [Kraemer 2000]. Da bei der Phosphorylierung der
Glucose über die Glucokinase ATP benötigt wird, war zudem denkbar, dass im Verhältnis
mehr Glucose in den Zitronensäurezyklus und die ATP-Produktion abfloss. Von Chen u. a.
[Chen u. a. 1997] wurde für die Glucoseaufnahme über die Galactose-Permease postuliert,
dass die Stämme weniger ATP zur Verfügung hatten und daher mehr Kohlendioxid
zur Energieversorgung der Zelle produzierten. Unter dem Vorbehalt, dass die wie in
Abschnitt 5.2.1 beschrieben ermittelte Kohlendioxidmenge des PTS(-)-Stammes korrekt
war, floss bei dem PTS(-)-Stamm tatsächlich mehr Glucose in die Kohlendioxidproduktion
(Abb. 5.13).
Damit sind mögliche Ursachen für die Unterschiede in der Glucoseaufnahmerate
genannt. Eine höhere Glucoseaufnahme, die bei 30 g/l Glucose gegeben war, führte jedoch
nicht zu einer verbesserten L-Phenylalanin-Produktion. Daher waren möglicherweise eher
andere Ursachen für die geringere L-Phenylalanin-Produktion verantwortlich.
Über die genannten Ursachen hinaus war die Verfügbarkeit von E4P, dem zweiten
Vorläufermetaboliten der Aromatenbiosynthese möglicherweise limitierend, so dass eine
verbesserte Bereitstellung von PEP nicht zu einem höheren Fluss in die Aromatenbiosynthese
führte. Von Chandran u. a. [Chandran u. a. 2003] wurden Experimente zur
Shikimat-Produktion mit Glucoseaufnahme über den Glucose-Facilitator und zusätzlicher
plasmidkodierter Expression der Transketolase durchgeführt. Aufgrund der zusätzlichen
Überexpression der Transketolase zur verbesserten Bereitstellung von E4P konnten die
Shikimatkonzentration und die Selektivität gegenüber Stämmen mit Glucoseaufnahme
über das Phosphotransferase-System deutlich verbessert werden.
Demnach war eine Steigerung des Flusses in den Aromatenbiosyntheseweg durch
Veränderungen im Zentralstoffwechsel möglich, doch die Stämme mussten zuvor entsprechend
der genannten Punkte weiter entwickelt werden und Parameter wie die Induktion
angepasst werden, um am Ende die L-Phenylalanin-Produktion über die des PTS(+)-
Stammes hinaus zu steigern.
5.3.3 Theoretische und tatsächliche Selektivitäten
Von Schmidt wurden Untersuchungen zur maximalen theoretischen L-Phenylalanin-
Produktion basierend auf stöchiometrischen Modellen durchgeführt [Schmidt 1998]. Bei
Stämmen mit Phosphotransferase-System zur Glucoseaufnahme, bei denen eine Reaktion
85