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Valutazione sul modello in vitro di carcinoma squamocellulare di testa e collo dell’anticorpo monoclonale C225
Fig. A. Confronto a 24 h, 48 h e 72 h tra controlli (a),
cellule trattate con Cetuximab a concentrazione 10 μg/ml
(b) e Cetuximab a concentrazione 100 μg/ml (c) mediante
conta cellulare. Si osserva la significatività statistica tra le
cellule trattate con il farmaco ad entrambe le concentrazioni
e i controlli in prima giornata, mentre a 48 h statistificamente
significativo risulta solo il confronto tra il farmaco
a concentrazione maggiore ed il controllo.
effetto inibitorio sulla proliferazione delle Hep-2 mediante
una curva dose-risposta. I risultati (Fig. A) hanno
dimostrato come l’effetto inibitorio all’inizio del time
course abbia un’azione di inibizione della crescita nelle
prime 24-48 ore, che si riduce progressivamente nel
tempo. Le ipotesi plausibili a questo riguardo sono due:
l’attivazione di pathways cellulari che rendono la cellula
indipendente dalla stimolazione dell’EGFR; la presenza
di fattori che inattivano il farmaco degradandolo o superandone
l’azione con modalità competitiva. Nel secondo
esperimento si è evidenziato che l’effetto inibitorio sulla
crescita persiste per tutta la durata dell’esperimento
quando si effettua un’applicazione quotidiana del farmaco
(Fig. 1). Pertanto la perdita di efficacia dopo 24-48 ore
sarebbe dovuta alla degradazione del farmaco o “escape
competitivo” 5 : una linea cellulare resistente risponde all’inibizione
di una data attività enzimatica dando origine
ad un meccanismo di feedback che determina l’aumento
quantitativo dei recettori per i fattori di crescita. La somministrazione
giornaliera di Erbitux permette di ottenere
un’inibizione della proliferazione cellulare fino a 72 h,
termine oltre il quale l’inibizione non mantiene un andamento
costante nel tempo (Fig. 1). Ciò potrebbe essere
spiegato dalle possibili concomitanti modificazioni dei
Fig. 1. Confronto mediante conta cellulare a 24 h, 48 h e
72 h tra controlli (a), e cellule trattate con Anticorpo anti-
EGFR a concentrazione 100 μg/ml, applicato in monosomministrazione
(b) e quotidianamente (c). Si osserva la
significatività statistica tra le cellule trattate con entrambe
le modalità di applicazione del farmaco e i controlli già in
prima giornata, mentre statistificamente significativa appare
la differenza tra l’applicazione giornaliera del farmaco
e la sua applicazione in monosomministrazione a 72 h.
Fig. B. Valutazione dell’apoptosi mediante la metodica di
colorazione con colorante vitale Hoechst 33258 su cellule
trattate con Cisplatino a diverse concentrazioni. La percentuale
di cellule apoptotiche è calcolata come rapporto
del numero di cellule andate incontro a morte cellulare e
numero di cellule visibili per campo. Si apprezzano valori
statisticamente significativi rispetto al controllo per trattamenti
con concentrazione di Cisplatino uguale o maggiore
di 10 μg/ml, mentre alla concentrazione di 25 μg/ml la
percentuale di cellule apoptotiche risulta statisticamente
significativa anche rispetto ai 10 μg/ml e 15 μg/ml.
pathways dell’EGFR a livello genomico, responsabili di
una ridotta sensibilità all’azione del Cetuximab 2 , la cui
analisi genomica dell’amplificazione di EGFR ha portato
alla scoperta di mutazioni tumore-specifiche, la più comune
delle quali è la EGFRvIII: molecola tronca ligando
indipendente, correlata alla scarsa prognosi nei pazienti
affetti da glioblastoma. Il terzo esperimento è stato infine
disegnato con lo scopo di ipotizzare i meccanismi molecolari
attraverso cui agisce il Cetuximab come farmaco
concomitante con il Cisplatino. Abbiamo disegnato una
curva dose/risposta per scegliere il dosaggio più adeguato
alle necessità dello studio (Fig. B) risultato essere 15
mcg/ml, tale da ottenere un effetto subottimale, e quindi
passibile di potenziamento, ma comunque statisticamente
significativo rispetto al controllo. L’eventuale potenziamento
dell’apoptosi indotta dalla somministrazione
congiunta delle due molecole potrebbe essere giustificata
dalla possibilità che il Cetuximab possa agire inducendo
esso stesso l’apoptosi, ipotesi smentita da un esperimento
in cui l’applicazione di Cetuximab come unico farmaco
induceva una percentuale di apoptosi fisiologica,
sovrapponibile ai controlli. Nell’ultimo esperimento, infine,
viene messo in luce come l’applicazione congiunta
di Cisplatino ed Erbitux ad una concentrazione di 100
mcg/ml induca una morte cellulare che è significativamente
maggiore rispetto ai controlli ed all’applicazione
del Cisplatino da solo (Figg. 2, C). Ciò indicherebbe che
il Cetuximab non solo induce una inibizione della crescita
cellulare come dimostrato nei primi esperimenti, ma
interagisce con molecole in grado di generare apotosi,
potenziandone gli effetti, senza pur tuttavia essere in grado
di indurre esso stesso la morte cellulare programmata.
I meccanismi che potenzialmente sono chiamati in causa
sarebbero differenti: inibizione della capacità di riparare
il danno del DNA 6 , il C225 induce una ridistribuzione
del DNA-PK dal nucleo al citosol con una riduzione dei
livelli di DNA-PK nel nucleo cellulare, limitando così i
meccanismi di detezione dei DSB e di trasmissione dei
messaggi volti alle proteine riparatrici nella quale sud-
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