sodininkystė ir daržininkystė 25(4)

metodikà su neþymiomis modifikacijomis ir rinkinio “Quick Prep total RNA extraction
kit for the direct isolation of total RNA from most eukaryotic tissues or cells“
(Amersham Pharmacia Biotechsciences, UK) instrukcijà bei rekomendacijas. Uþðaldyta
-20°C temperatûroje virusu uþsikrëtusi augalinë medþiaga (apie 25 mg/g) uþpilama
skystu azotu ir homogenizuojama steriliame grûstuvëlyje. Dalis medþiagos atðaldytu
ðpateliu perkeliama á Ependorf mëgintuvëlius. Augalinë medþiaga uþpilama
1 x STE (0,1 M NaCl, 0,05 M TRIS, 0,001 M EDTA) buferiu pH 6,8 ir 10% SDS,
pridedant 2 x STE buferyje paruoðto fenolo. Po to centrifuguojama ir virðutinë fazë
perkeliama á naujà mëgintuvëlá. Tirpalas uþpilamas 30% etanoliu ir pridedama celiuliozës
Whatman CF-11 milteliø. Celiuliozë iðplaunama maiðant ir centrifuguojant 3
kartus su 1 x STE buferiu, esant 16,5% etanolio. RNR nusodinama su 3 M natrio
acetatu ir etanoliu, inkubuojama esant -20°C temperatûrai. Perplaunama 80% etanoliu,
po to resuspenduojama PGR vandenyje.
Naudojant pirmiau minëtà totalinës RNR ekstrakcijos rinkiná, tiriamosios medþiagos
milteliai po homogenizacijos skystame azote uþpilami 150 μl ekstrakcijos
buferio ir 3 μl 14,3 M β-merkaptoetanolio. Pridedama 350 μl LiCl ir 500 μl CsTFA.
Mëgintuvëliai 10 min. palaikomi lede, po to centrifuguojami 15 min./14 000 g. Nusiurbiami
susidaræ baltymø ir DNR sluoksniai. Gautos RNR nuosëdos plaunamos trimis
rinkinio komponentais, kad bûtø paðalintas baltymø ir DNR uþterðtumo pervirðis,
esantis ant nuosëdø ar mëgintuvëliø sieneliø. Po to centrifuguojama 5 min./14 000 g.
Nusiurbiamas supernatantas. Precipitatai uþpilami 70% etanoliu, paruoðtu PGR vandenyje.
Po to medþiaga inkubuojama paliekant ilgesná laikà -20°C temperatûroje. Po
inkubacijos centrifuguojama 5 min./14 000 g. Nusiurbiamas etanolis. Nuosëdos uþpilamos
dejonizuotu H 2
O, paveiktu dietilpirokarbonatu (DEPC), ir pridedama ribonukleaziø
inhibitoriaus. Nuosëdos suardomos ir tirpinamos maiðant. Mëgintuvëliai
paðildomi 10 min. +65°C temperatûros vandens termostate. Iðtirpinta totalinë RNR
buvo naudojama PGR.
Siekiant atlikti ið pomidorø iðskirtø virusø detekcijà atvirkðtinës transkriptazës
(AT) PGR metodu (Dijkstra de Jager, 1998; Forster, Taylor, 1998), naudotasi specifiniais
oligonukleotidø pradmenimis, kurie buvo parinkti pagal tiksliai þinomas viruso
baltymo geno sekas. Pradmenø poros ið pomidorø iðskirtø virusø biologinei diagnostikai
patvirtinti buvo ðios: CMV: U (5’ – GTA GAC ATC TGT GAC GCG GA-3’) nt
114-132 ir D ( 5’ – GCG CGA AAC AAG CTT CTT ATC – 3’) nt 633-653 (De Blas
ir kt., 1994); ToRSV: U1 (5’ – GAC GAA GTT ATC AAT GGC AGC – 3’) (nt 1.078-
1.098) ir D1 (5’ – TCC GTC CAA TCA CGC GAA T – 3’) nt 1.506-1.527) (Griesbach,
1995); ArMV: AP1 2 (5’ – AAT ACC CCG GGT GTT ACA TCG – 3’) ir AP2 2
(5’ – CAT TAA CTT AAG ATC AAG GAT TC – 3’) (Pantaleo ir kt., 2001). DNR
fragmentø dydþio standartas buvo þymuo Nr. 9: Ôx174DNA/BsuRI(HaeIII) (AB
„Fermentas“, Vilnius, Lietuva). Dydþiai ið virðaus á apaèià: 1353, 1078, 872, 603,
310, 281, 271, 234, 194, 118, 72 bp.
AT-PGR trumpa schema: á valytos totalinës RNR tirpalà jai denatûruoti pridëta
1% ribonukleaziø inhibitoriaus ir reversinio pradmens. Miðinys inkubuojamas 5 min.
+70°C ir atðaldomas 5 min. +4°C temperatûroje. Vienvijës cDNR sintezë atliekama á
denatûruotos RNR tirpalà pridëjus 5 x reakcijos buferio, ribonukleaziø inhibitoriaus,
dNTP miðinio ir AT (RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase). Sintezuojama
232