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and the GLP-1 (7 – 36) amide during IVGTT following DPP4 inhibitor administration. Methods: Groups of catheterized Wistar rats were tested: placebo (P; 0.1% BSA), DPP4 inhibitor (INH; 30 mmol/kg P32/98, p. o.), incretin in the absence (+P) and presence of INH (+INH) three days apart in a random order. 4.0 nmol/kg GLP-1 ((7 – 36) amide; Neo MPS; Strasbourg, France) or 2.0 nmol/kg GIP (Probiodrug AG, Halle/Saale, Germany) were injected. Samples for blood glucose (BG) and insulin (I) were taken (Ÿ 5, 0 min and at 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 25, 40 and 60 min). INH was given at Ÿ 20 min, the incretin at Ÿ 5 min and the IVGTT (0.4 g glucose/kg) commenced at 0 min. G- and I- AUC0 – 25 min, insulinogenic Index iI (I- and G-AUC area quotient (ng/mmol) was selected to measure incretin effects), glucose efflux K G (%/min; Conard (1959)) was calculated from IVGTT curves. Groups were compared with two-tailed t-test with Bonferroni-Holm correction, a *p < 0.05 was considered significant. Results: INH significantly increased the effects of GIP – G-AUC (P+P: 220 € 34, INH+P: 185 € 17, P+GIP: 157 € 14*, INH+GIP: 156 € 25* mmol·min/L), I-AUC (P+P: 77 € 33, INH+P: 60 € 19, P+GIP: 115 € 34, INH+GIP: 153 € 39* ng·min/mL) and Ii (P+P: 0.35 € 0.17, INH+P: 0.33 € 0.11, P+GIP: 0.74 € 0.24*, INH+GIP: 0.99 € 0.26* ng/mmol) and improved glucose efflux KG (P+P: 14.5 € 4.1, INH+P: 14.2 € 2.4, P+GIP: 19.8 € 3.1*, INH+GIP: 20.5 € 5.0*%/min). In contrast, INH attenuated GLP-1 effects – G-AUC (P+P: 226 € 33, INH+P: 182 € 20*, P+GLP-1: 183 € 24, INH+GLP-1: 215 € 14 mmol·min/L), I-AUC (P+P: 63 € 28, INH+P: 65 € 33, P+GLP-1: 125 € 19*, INH+GLP-1: 106 € 38 ng·min/mL) and Ii (P+P: 0.27 € 0.10, INH+P: 0.35 € 0.16, P+GLP-1: 0.70 € 0.18*, INH+GLP-1: 0.50 € 0.19 ng/ mmol) and declined glucose efflux KG (P+P: 12.6 € 5.1, INH+P: 14.5 € 3.0, P+GLP-1: 14.9 € 3.1, INH+GLP-1: 11.1 € 3.7%/min). Conclusions: DPP4 inhibition revealed that GLP-1 and GIP differ remarkably in their glucoregulatory actions in healthy rats. These previously unrecognized actions of DPP4 inhibitors may have implications for the use of DPP-4 inhibitors in humans. We thank Prosidion Ltd., Oxford, and Probiodrug AG, Halle/Salle, for donation of DPP4 inhibitor and GIP compound. FV61 Immunmodulierende Wirkung einer adjuvanten Behandlung mit 1a,25(OH)2Vitamin D3 auf dendritische Zellen bei Patienten mit neu manifestiertem Typ 1-Diabetes Försch J 1 , Monti P 2 , Bonifacio E 2 , Walter M 1 , Achenbach P 1 , Ziegler AG 1 1 Institut für Diabetesforschung der Forschergruppe Diabetes e.V. am Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Germany, 2 DFG Center for Regenerative Therapies, Technische Universität Dresden, Dresden, Germany Fragestellung: Für Vitamin D 3 wurde eine protektive Wirkung auf die Entstehung von Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) beschrieben. Die aktive Form dieses Vitamins (1a,25(OH) 2D 3; Calcitriol) beeinflusst die Differenzierung, Reifung und Funktion von dendritischen Zellen (DC). Wir haben untersucht, ob Patienten mit neu manifestiertem T1DM, die im Rahmen einer Präventionsstudie mit 1a,25(OH)2Vitamin D3 behandelt wurden, Veränderungen in den DC-Subpopulationen aufweisen, die für eine immunologische Wirksamkeit der Intervention sprechen. Methodik: In einer doppelblinden, randomisierten, placebokontrollierten Phase II Studie wurden 40 neu manifestierte T1DM-Patienten über einen Zeitraum von neun Monaten täglich mit entweder 0,25 mg oralem Calcitriol (n = 22; medianes Alter € SD, 31,4 € 6,8 Jahre; 16 männlich) oder oralem Placebo (n = 18; 24,0 € 6,0 Jahre; 13 männlich) behandelt und danach für weitere neun Monate beobachtet. Mononukleäre Zellen wurden bei Einschluss in die Studie und nach 3, 6, 9, 12 und 18 Monaten aus peripherem Blut isoliert. Die Anzahl der DC sowie der Anteil an plasmazytoiden und myeloiden DC-Subpopulationen (PDC, MDC 1, MDC 2) wurden vor Beginn der Behandlung und nach 9, 12 und 18 Monaten mittels FACS bestimmt und jeweils zwischen den Behandlungsgruppen verglichen. Innerhalb jeder Behandlungsgruppe wurden Veränderungen im Verlauf analysiert. Ergebnisse: Im Verlauf der Intervention kam es zu einer signifikanten Abnahme der DC bei Calcitriol-behandelten Patienten (p = 0,03). Für die Placebogruppe wurde dies nicht beobachtet. Nach neun Monaten Behandlung bestand zwischen beiden Gruppen ein signifikanter Unterschied im Anteil der DC an der Gesamtzahl mononukleärer Zellen (median 0,71%, IQR 0,49 – 0,93, bei Calcitriol-Behandlung; vs. 0,96%, IQR 0,67 – 1,17, bei Placebo-Behandlung; p = 0,04). Hinsichtlich der DC-Subpopulationen wurde ein signifikant niedrigerer Anteil an PDC bei Calcitriol-behandelten Patienten beobachtet (median 0,34%, IQR 0,22 – 0,48; vs. 0,49%, IQR 0,34 – 0,82; p = 0,03); die MDC 1 und MDC 2 unterschieden sich dagegen nicht. Sechs Patienten in der Interventionsgruppe zeigten im Monat 9 eine besonders deutliche Ab- 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart nahme der PDC auf < 50% der Ausgangswerte (potentielle „Responder“). Nach Abschluss der Behandlung (im Monat 12 und 18) wurden keine Unterschiede in der Anzahl der DC oder der DC-Subpopulationen zwischen den Behandlungsgruppen nachgewiesen. Schlussfolgerung: Während einer adjuvanten Behandlung mit täglich 0,25 mg Calcitriol bei neu manifestierten T1DM-Patienten vermindert sich die Anzahl der DC und insbesondere der PDC-Subpopulation. Dies lässt auf eine immunmodulierende Wirkung von 1a,25(OH)2Vitamin D3 schließen. Gefördert durch DDG und EU (EP7-HEALTH-2007, DIAPREPP N202013). FV62 Erhalt der Beta-Zellrestfunktion nach Diabetesmanifestation durch Kombinationstherapie mit CD 3-Antikörper und FTY720 oder einem TNF-a-Antikörper in der IDDM (LEW.1AR1-iddm) Ratte als Tiermodell des menschlichen Typ 1 Diabetes Jörns A 1 , Akin M 1 , Ertekin G 1 , Arndt T 1 , Meyer zu Vilsendorf A 2 , Taivankhuu T 1 , Lenzen S 1 1 Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Biochemie, Hannover, Germany, 2 Medizinische Hochschule Hannover, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Hannover, Germany Fragestellung: Durch die Gabe eines rattenspezifischen CD3-Antikörpers (CD 3-AB) in der Kombination mit einem weiteren immunmodulatorischen Agens (FTY720 oder TNF-a-AB) sollte die Beta-Zellrestfunktion nach Diabetesmanifestation in der IDDM (LEW.1AR1-iddm) Ratte länger erhalten werden. Durch den Vergleich sollen Aussagen zur additiven Wirkung beider Kombinationen aufgezeigt werden, da unter alleiniger CD 3-AB-Therapie beim Menschen der Erhalt der Restfunktion der Beta- Zellen, über C-Peptid bestimmt, nur für 1 Jahr erzielt werden konnte. Methodik: Für die Sekundärprävention wurden die akut diabetischen Tiere mit CD 3-AB (Klon R73, 250 mg/kg Körpergewicht, i. v. Injektion) über 5 Tage konsekutiv in Kombination entweder mit dem TNF-a-AB (5 Tage konsekutiv, 16 mg/kg, Körpergewicht, i. v. Injektion) oder mit FTY720 (40 Tage, 1 mg/kg Körpergewicht oral) behandelt. Der Erfolg der Therapie wurde biochemisch kontrolliert. Die Infiltration der Inseln und die Beta-Zellen wurden durch Biopsien direkt nach Diabetesmanifestation, nach Therapieende und 60 Tage danach immunhistochemisch und ultrastrukturell analysiert. Ergebnisse: Im Rahmen der Sekundärprävention ließen sich bei beiden Kombinationstherapien 2 Gruppen, nämlich einerseits Tiere mit wiedergewonnener Normoglykämie und andererseits Tiere, die trotz Therapie diabetisch blieben, voneinander unterscheiden. Bei beiden kombinierten Präventionsstrategien fiel auf, dass nur Tiere mit Blutglucosekonzentrationen zwischen 10 – 15 mmol/l „geheilt“ werden konnten, wohingegen die Hyperglykämie bei den anderen akut diabetischen Tieren noch weiter anstieg und die Tiere mit Insulin substituiert werden mussten. In der 1. Pankreasbiopsie fanden sich stark mit Makrophagen und CD 8 T-Lymphozyten infiltrierte Inseln mit einem geringen Beta-Zellanteil in allen akut diabetischen Tieren vor Beginn der kombinierten Präventionstherapie. In der 2. Pankreasbiopsie war nur bei Tieren nach Rückkehr zur Normoglykämie ein deutlicher Rückgang des Immunzellinfiltrats in den Inseln und im umgekehrten Verhältnis ein dramatischer Anstieg der Beta-Zellen zu verzeichnen. In den nicht geheilten Tieren waren am Ende der Therapie nur noch wenige Beta-Zellen in den infiltrierten Inseln zu finden. Der Rückgang des Infiltrats nach beiden Therapien war 60 Tage nach Therapieende in den geheilten Tieren noch weiter fortgeschritten. Die Beta-Zellen wiesen zu diesem Zeitpunkt auch ultrastrukturell keine Zeichen einer Schädigung in den einzelnen Zellorganellen auf, was mit einem hohen C-Peptidspiegel korrelierte. Schlussfolgerungen: Durch eine kombinierte Therapie mit CD 3-AB und TNF-a-AB können zusätzlich zu den inaktiven T-Zellen das aus Makrophagen freigesetzte TNF-a blockiert oder durch zusätzliche Gabe von FTY720 der Nachschub aktivierter T-Lymphozyten verhindert werden. Beide Kombinationstherapien sind hinsichtlich Persistenz und Vermehrung der Beta-Zellzahl gleich gut wirksam. Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 S21
S22 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart FV63 Die Zerstörung mitochondrialer Strukturen der Skelettmuskulatur als zentraler Bestandteil im Pathomechanismus des Typ 2 Diabetes mellitus Oberbach A 1 , Lehmann S 1 , Till H 2 , Schlichting N 3 , Kovacs P 4 , Schleinitz D 4 , Breitfeld J 4 , Binder H 5 , Wirth H 5,6 , Bergen M von 7 , Fitzl G 8 , Neuhaus J 9 , Blüher M 1 1 Universität Leipzig, Medizinische Klinik III, Endokrinologie, Leipzig, Germany, 2 Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Kinderchirurgie, Leipzig, Germany, 3 Universität Leipzig, Leipzig, Germany, 4 Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung, Universität Leipzig, Leipzig, Germany, 5 Universität Leipzig, Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik, Leipzig, Germany, 6 UFZ Leipzig, Department für Proteomics und Metabolomics, Leipzig, Germany, 7 UFZ Leipzig, Leipzig, Germany, 8 Universität Leipzig, Institut für Anatomie, Leipzig, Germany, 9 Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Urologie, Leipzig, Germany Einleitung: Die Skelettmuskulatur stellt im Pathomechanismus des Typ 2 Diabetes (T2D) ein zentrales Organ dar. Vor allem mitochondriale Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur assoziieren mit der Entwicklung eines T2D. Im Fokus der Studie stand der pathophysiologische Übergang vom metabolischen Syndrom zum T2D. Insbesondere sollte der Bezug zwischen dem Radikalestoffwechsel und der posttranslationalen Modifikation durch Carbonylierung von Proteinen dargestellt werden. Methodik: Hierfür untersuchten wir 8 Probanden mit normaler Glucosetoleranz (NGT) sowie 12 Patienten mit T2D. Die Patienten wurden gematched nach Alter, BMI und prozentualem Körperfettanteil. Nach Biopsie des M. Vastus lateralis wurden morphometrische Analysen durchgeführt. Die globale Proteomdarstellung erfolgte mittels Differenzial in Gel Electrophoresis (DIGE) und anschließender Identifikation signifikant regulierter Proteine durch Massenspektrometrie (MS) sowie MS/MS-Analyse. Die Veränderungen der Carbonylierung wurden mittels Alexa-488-Hydroxilamin-Färbung in 2D-Gelen erfasst. Ergebnisse: Die Studie zeigte eine T2D-basierte Zerstörung mitochondrialer Strukturen bei differenziellem Proteinexpressionsmuster und pathophysiologisch abhängiger Proteincarbonylierung. Die Anzahl nuklearer DNA Kopien im Verhältnis zu mitochondrialer DNA Kopien unterschieden sich nicht im direkten Vergleich. Auf der Basis morphometrischer Untersuchungen präsentierte sich eine signifikante Erhöhung mitochondrialer Destruktion, vor allem in den glykolytisch arbeitenden Muskelfasern der T2D-Patienten. Die anschließende Protoemanalyse von Muskelzellen wies nach Auswertung mittels Gene enrichment für den T2D eine signifikante Reduktion des Nitrogenmetabolismus und der Apoptoseregulation bei einer statistisch relevanten Erhöhung der Glykolyse des Oxygentransports sowie der Zellmitose und der Zelldifferenzierung auf. Ausgelöst durch den mitochondrialen Untergang unterlag der diabetische Skelettmuskel einer hohen Rate an oxidativem Stress sowohl im Bereich der Lipidperoxidation, der Radikalisierung von Nukleinsäuren als auch der posttranslationalen Modifkation der Proteine durch Carbonylierung. Die 2D-DIGE gekoppelte Proteomanalyse carbonylierter Proteine ergab eine T2D spezifische posttranslationale Modifikation des Skelettmuskelproteoms. Vor allem die Proteine kontraktiler Strukturen und des Glukosestoffwechsels unterlagen dem Einfluss freier Radikale. Schlussfolgerungen: Die gezeigten Untersuchungsergebnisse stellen insbesondere den Untergang mitochondrialer Strukturen als ein Pathomechanismus des T2D heraus. Mögliche therapeutische Ansätze zur Verbesserung des Glukosestoffwechsels der Muskelzelle sollen vor allem die Regenerationsfähigkeit mitochondrialer Strukturen implementieren. Insbesondere bewegungstherapeutische Interventionen sind in der Lage zelluläre Strukturen zu regenerieren. Hierfür müssen spezifische Belastungsprogramme evaluiert werden. FV64 Insulinrezeptorsubstrat (IRS)2-Expression moduliert die Amyloid-Precursor-Protein (APP) Spaltung in vivo Udelhoven M 1 , Ehlkes T 1 , Hettich MM 1 , Asrat S 1 , Krone W 1 , Schubert M 1 1 Uniklinik Köln, Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin und Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK), Köln, Germany Fragestellung: Klinische Studien konnten eine Assoziation von Diabetes mellitus Typ 2 und Morbus Alzheimer zeigen. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass vaskuläre Komplikationen zu einer Neurodegeneration führen. Alternativ kann diese Assoziation auch in direktem Zusammenhang zur Insulinrezeptor/Insulin-like Growth Faktor- 1-Rezeptor-Signaltransduktion stehen. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass post mortem Untersuchungen der Gehirne von Alzheimer- Patienten eine deutliche Abnahme der IRS 2-Expression zeigen. Da die proteolytische Spaltung von APP durch die b- und g-Sekretase wesentlich zur Pathogenese des Morbus Alzheimer beiträgt, haben wir die Bedeutung der IRS 2-Expression auf die sekretasenvermittelte APP-Spaltung in humanen Neuroblastomazellen (SHSY5Y) untersucht. Methodik: Durch stabile siRNA-Expression haben wir eine SHSY5Y-Zelllinie generiert, die ca. 75% weniger IRS 2 exprimiert (IRS 2-knockdown). Mittels Dichtegradientenzentrifugation wurde die Lokalisation der Sekretasen und APP-Spaltprodukte (APP c-terminale Fragmente, CTFs) in verschieden Membranfraktionen untersucht. Ergebnisse: Western Blot Analysen der unterschiedlichen Membranfraktionen haben gezeigt, dass in Wildtyp SHSY5Y-Zellen CTFs fast ausschließlich in Rab5 positiven Membranabschnitten vorkommen. Demzufolge wird endogenes APP in Wildtyp- Zellen bevorzugt in frühen Endosomen gespalten. In IRS2-knockdown- Zellen traten jedoch fast 80% weniger CTFs in Rab5 positiven Membranenabschnitten verglichen mit Wildtyp-Zellen auf. Inkubation der Zellen mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 führte ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der CTFs in Rab5 positiven Membranen. Demzufolge ist die endosomale Spaltung von endogenem APP PI3-Kinase mediiert. Western Blot Analysen von Wildtyp-Zellen ergaben, dass sowohl BACE1 (b-Sekretase) als auch Presenilin-1 (enzymatisch-aktiver Teil des g-Sekretase Komplex, PS 1) in Endosomen vorkommen. Die endosomale PS 1-Expression war jedoch signifikant höher in IRS 2 knockdown-Zellen verglichen mit Wildtyp-Zellen. Behandlung von Wildtyp-Zellen mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 zeigte den gleichen Effekt bezüglich der PS 1-Lokalisation wie unter IRS2-knockdown-Bedingungen. Dementsprechend ist die endosomale Lokalisation von PS 1 unter PI3-Kinase- Inhibition höher, ohne jedoch die APP-Spaltung zu verstärken. Um den Einfluss von IRS2 auf die b-Sekretaseaktivität zu untersuchen, haben wir in IRS 2-knockdown- und IRS2-überexprimerenden Zellen die b-Sekretaseaktivität bestimmt. Ein IRS 2-knockdown führte zu einer Abnahme, eine IRS 2-Überexpression dagegen zu einer Zunahme der b-Sekretaseaktivität. Dies könnte möglicherweise die verminderte APP-Spaltung in IRS 2-knockdown-Zellen erklären. Schlussfolgerungen: IRS 2-mediierte Signale vermitteln die endosomale APP-Spaltung sowie die subzelluläre Lokalisation und/oder Aktivität der beteiligten Sekretasen. FV65 Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 Wirkung einer Langzeitbehandlung mit suberythro-poietischer EPO Dosis auf die diabetische Retinopathie im Rattenmodell Wang Q 1 , Hammes AG 1 V. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin Mannheim, Universität Heidelberg, Mannheim, Germany Einleitung: Periyztenverlust und Vasoregression charakterisieren die diabetische Retinopathie in der Klinik und im Tiermodel. Eine milde Neurodegeneration mit Verlust von Ganglienzellen wird ebenfalls beschrieben. VEGF-A wird in der nicht-hypoxischen Retina von diabetischen Nagern durch oxidativen Stress und AGEs hochreguliert und ist neuroprotektiv. Wie VEGF-A ist Erythropoietin (EPO) angioprotektiv, in hoher Dosis auch angiogen, und neuroprotektiv. Ziel unserer Studie war es, die Wirkung einer nicht-hämtopoietischen Dosis von EPO auf vaskuläre Schäden und Neurodegeneration im Rattenmodel der diabetischen Retinopathie zu untersuchen. Material und Methoden: Diabetes wurde in den Wistar-Ratten in der 6. Lebenswoche durch Streptozotozin (i. v., 30 mg/kg KG) induziert. EPO wurde ab der 2. Woche nach der Diabetesinduktion i. p. für 6 Monate appliziert. Die Ratten wurden in drei Gruppen eingeteilt: nicht-diabetische Gruppe (N), diabetische Gruppe (D) und diabetische mit EPO behandelte Gruppe (D+EPO 3 x 256 IE/kg KG/ Woche). Perizyten und azellulären Kapillarsegmenten (AZ) wurden in Retina-Digestionspräparaten quantifiziert. Proteinexpression von VEGF-A wurde nach 3 Monaten EPO-Gabe durch Elisa erfasst. Die Schichtdicke von Gagnlienzellschicht (GCL), innerer (INL) und äußerer Körnerschicht (ONL) sowie der gesamten Retina wurde gemessen. Die Zellzahlen in GCL (500 mm), INL (100 mm) und ONL (50 mm) wurde mit dem IM50-Programm auf einem Leica DMRBE Mikroskop gezählt. Ergebnisse: 6 Monate EPO-Therapie hatte keine Effekte auf Körpergewicht (KG), Blutzucker (BZ) und Glykohämoglobin (HbA1c) im Vergleich zu den unbehandelten diabetischen Tieren (KG: N 570 € 52 g, D 384 € 36 g, D+EPO 364 € 33 g; BZ: N 101 € 13 mg/dl, D 595 € 15 mg/dl, D+EPO 593 € 18 mg/dl; HbA1c: N 5,6 € 0,2%, D 12,0 € 2,1%, D+EPO 13,6 € 2,8%). Nach 6 Monaten hatte die diabetische Gruppe 22% Perizytenverlust (D vs. N, p < 0,0001), der durch EPO Behandlung um ~50% reduziert wurde (D+EPO vs. D, p < 0,01). AZ wurden in der diabetischen Retina zweifach vermehrt (D vs. N, p < 0,0001) und durch EPO Behandlung normaliziert
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