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S22 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart
FV63
Die Zerstörung mitochondrialer Strukturen der
Skelettmuskulatur als zentraler Bestandteil im
Pathomechanismus des Typ 2 Diabetes mellitus
Oberbach A 1 , Lehmann S 1 , Till H 2 , Schlichting N 3 , Kovacs P 4 ,
Schleinitz D 4 , Breitfeld J 4 , Binder H 5 , Wirth H 5,6 , Bergen M
von 7 , Fitzl G 8 , Neuhaus J 9 , Blüher M 1
1 Universität Leipzig, Medizinische Klinik III, Endokrinologie,
Leipzig, Germany, 2 Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik
für Kinderchirurgie, Leipzig, Germany, 3 Universität Leipzig,
Leipzig, Germany, 4 Interdisziplinäres Zentrum für Klinische
Forschung, Universität Leipzig, Leipzig, Germany,
5 Universität Leipzig, Interdisziplinäres Zentrum für
Bioinformatik, Leipzig, Germany, 6 UFZ Leipzig, Department
für Proteomics und Metabolomics, Leipzig, Germany, 7 UFZ
Leipzig, Leipzig, Germany, 8 Universität Leipzig, Institut für
Anatomie, Leipzig, Germany, 9 Universität Leipzig, Klinik und
Poliklinik für Urologie, Leipzig, Germany
Einleitung: Die Skelettmuskulatur stellt im Pathomechanismus des Typ
2 Diabetes (T2D) ein zentrales Organ dar. Vor allem mitochondriale
Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur assoziieren mit der Entwicklung
eines T2D. Im Fokus der Studie stand der pathophysiologische
Übergang vom metabolischen Syndrom zum T2D. Insbesondere sollte
der Bezug zwischen dem Radikalestoffwechsel und der posttranslationalen
Modifikation durch Carbonylierung von Proteinen dargestellt werden.
Methodik: Hierfür untersuchten wir 8 Probanden mit normaler
Glucosetoleranz (NGT) sowie 12 Patienten mit T2D. Die Patienten wurden
gematched nach Alter, BMI und prozentualem Körperfettanteil.
Nach Biopsie des M. Vastus lateralis wurden morphometrische Analysen
durchgeführt. Die globale Proteomdarstellung erfolgte mittels Differenzial
in Gel Electrophoresis (DIGE) und anschließender Identifikation signifikant
regulierter Proteine durch Massenspektrometrie (MS) sowie
MS/MS-Analyse. Die Veränderungen der Carbonylierung wurden mittels
Alexa-488-Hydroxilamin-Färbung in 2D-Gelen erfasst. Ergebnisse: Die
Studie zeigte eine T2D-basierte Zerstörung mitochondrialer Strukturen
bei differenziellem Proteinexpressionsmuster und pathophysiologisch
abhängiger Proteincarbonylierung. Die Anzahl nuklearer DNA Kopien
im Verhältnis zu mitochondrialer DNA Kopien unterschieden sich nicht
im direkten Vergleich. Auf der Basis morphometrischer Untersuchungen
präsentierte sich eine signifikante Erhöhung mitochondrialer Destruktion,
vor allem in den glykolytisch arbeitenden Muskelfasern der T2D-Patienten.
Die anschließende Protoemanalyse von Muskelzellen wies nach
Auswertung mittels Gene enrichment für den T2D eine signifikante Reduktion
des Nitrogenmetabolismus und der Apoptoseregulation bei einer
statistisch relevanten Erhöhung der Glykolyse des Oxygentransports
sowie der Zellmitose und der Zelldifferenzierung auf. Ausgelöst durch
den mitochondrialen Untergang unterlag der diabetische Skelettmuskel
einer hohen Rate an oxidativem Stress sowohl im Bereich der Lipidperoxidation,
der Radikalisierung von Nukleinsäuren als auch der posttranslationalen
Modifkation der Proteine durch Carbonylierung. Die
2D-DIGE gekoppelte Proteomanalyse carbonylierter Proteine ergab eine
T2D spezifische posttranslationale Modifikation des Skelettmuskelproteoms.
Vor allem die Proteine kontraktiler Strukturen und des Glukosestoffwechsels
unterlagen dem Einfluss freier Radikale. Schlussfolgerungen:
Die gezeigten Untersuchungsergebnisse stellen insbesondere den
Untergang mitochondrialer Strukturen als ein Pathomechanismus des
T2D heraus. Mögliche therapeutische Ansätze zur Verbesserung des Glukosestoffwechsels
der Muskelzelle sollen vor allem die Regenerationsfähigkeit
mitochondrialer Strukturen implementieren. Insbesondere bewegungstherapeutische
Interventionen sind in der Lage zelluläre Strukturen
zu regenerieren. Hierfür müssen spezifische Belastungsprogramme
evaluiert werden.
FV64
Insulinrezeptorsubstrat (IRS)2-Expression
moduliert die Amyloid-Precursor-Protein (APP)
Spaltung in vivo
Udelhoven M 1 , Ehlkes T 1 , Hettich MM 1 , Asrat S 1 , Krone W 1 ,
Schubert M 1
1 Uniklinik Köln, Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin
und Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK), Köln,
Germany
Fragestellung: Klinische Studien konnten eine Assoziation von Diabetes
mellitus Typ 2 und Morbus Alzheimer zeigen. Eine mögliche Erklärung
für diese Beobachtung ist, dass vaskuläre Komplikationen zu einer Neurodegeneration
führen. Alternativ kann diese Assoziation auch in direktem
Zusammenhang zur Insulinrezeptor/Insulin-like Growth Faktor-
1-Rezeptor-Signaltransduktion stehen. Diese Hypothese wird dadurch
gestützt, dass post mortem Untersuchungen der Gehirne von Alzheimer-
Patienten eine deutliche Abnahme der IRS 2-Expression zeigen. Da die
proteolytische Spaltung von APP durch die b- und g-Sekretase wesentlich
zur Pathogenese des Morbus Alzheimer beiträgt, haben wir die
Bedeutung der IRS 2-Expression auf die sekretasenvermittelte APP-Spaltung
in humanen Neuroblastomazellen (SHSY5Y) untersucht. Methodik:
Durch stabile siRNA-Expression haben wir eine SHSY5Y-Zelllinie generiert,
die ca. 75% weniger IRS 2 exprimiert (IRS 2-knockdown). Mittels
Dichtegradientenzentrifugation wurde die Lokalisation der Sekretasen
und APP-Spaltprodukte (APP c-terminale Fragmente, CTFs) in verschieden
Membranfraktionen untersucht. Ergebnisse: Western Blot Analysen
der unterschiedlichen Membranfraktionen haben gezeigt, dass in Wildtyp
SHSY5Y-Zellen CTFs fast ausschließlich in Rab5 positiven Membranabschnitten
vorkommen. Demzufolge wird endogenes APP in Wildtyp-
Zellen bevorzugt in frühen Endosomen gespalten. In IRS2-knockdown-
Zellen traten jedoch fast 80% weniger CTFs in Rab5 positiven Membranenabschnitten
verglichen mit Wildtyp-Zellen auf. Inkubation der Zellen
mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 führte ebenfalls zu einer deutlichen
Reduktion der CTFs in Rab5 positiven Membranen. Demzufolge ist
die endosomale Spaltung von endogenem APP PI3-Kinase mediiert.
Western Blot Analysen von Wildtyp-Zellen ergaben, dass sowohl BACE1
(b-Sekretase) als auch Presenilin-1 (enzymatisch-aktiver Teil des g-Sekretase
Komplex, PS 1) in Endosomen vorkommen. Die endosomale
PS 1-Expression war jedoch signifikant höher in IRS 2 knockdown-Zellen
verglichen mit Wildtyp-Zellen. Behandlung von Wildtyp-Zellen mit dem
PI3K-Inhibitor LY294002 zeigte den gleichen Effekt bezüglich der
PS 1-Lokalisation wie unter IRS2-knockdown-Bedingungen. Dementsprechend
ist die endosomale Lokalisation von PS 1 unter PI3-Kinase-
Inhibition höher, ohne jedoch die APP-Spaltung zu verstärken. Um den
Einfluss von IRS2 auf die b-Sekretaseaktivität zu untersuchen, haben wir
in IRS 2-knockdown- und IRS2-überexprimerenden Zellen die b-Sekretaseaktivität
bestimmt. Ein IRS 2-knockdown führte zu einer Abnahme,
eine IRS 2-Überexpression dagegen zu einer Zunahme der b-Sekretaseaktivität.
Dies könnte möglicherweise die verminderte APP-Spaltung in
IRS 2-knockdown-Zellen erklären. Schlussfolgerungen: IRS 2-mediierte
Signale vermitteln die endosomale APP-Spaltung sowie die subzelluläre
Lokalisation und/oder Aktivität der beteiligten Sekretasen.
FV65
Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002
Wirkung einer Langzeitbehandlung mit
suberythro-poietischer EPO Dosis auf die
diabetische Retinopathie im Rattenmodell
Wang Q 1 , Hammes AG
1 V. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin Mannheim,
Universität Heidelberg, Mannheim, Germany
Einleitung: Periyztenverlust und Vasoregression charakterisieren die
diabetische Retinopathie in der Klinik und im Tiermodel. Eine milde
Neurodegeneration mit Verlust von Ganglienzellen wird ebenfalls beschrieben.
VEGF-A wird in der nicht-hypoxischen Retina von diabetischen
Nagern durch oxidativen Stress und AGEs hochreguliert und ist
neuroprotektiv. Wie VEGF-A ist Erythropoietin (EPO) angioprotektiv, in
hoher Dosis auch angiogen, und neuroprotektiv. Ziel unserer Studie war
es, die Wirkung einer nicht-hämtopoietischen Dosis von EPO auf vaskuläre
Schäden und Neurodegeneration im Rattenmodel der diabetischen
Retinopathie zu untersuchen. Material und Methoden: Diabetes wurde
in den Wistar-Ratten in der 6. Lebenswoche durch Streptozotozin (i. v.,
30 mg/kg KG) induziert. EPO wurde ab der 2. Woche nach der Diabetesinduktion
i. p. für 6 Monate appliziert. Die Ratten wurden in drei Gruppen
eingeteilt: nicht-diabetische Gruppe (N), diabetische Gruppe (D)
und diabetische mit EPO behandelte Gruppe (D+EPO 3 x 256 IE/kg KG/
Woche). Perizyten und azellulären Kapillarsegmenten (AZ) wurden in
Retina-Digestionspräparaten quantifiziert. Proteinexpression von
VEGF-A wurde nach 3 Monaten EPO-Gabe durch Elisa erfasst. Die
Schichtdicke von Gagnlienzellschicht (GCL), innerer (INL) und äußerer
Körnerschicht (ONL) sowie der gesamten Retina wurde gemessen. Die
Zellzahlen in GCL (500 mm), INL (100 mm) und ONL (50 mm) wurde mit
dem IM50-Programm auf einem Leica DMRBE Mikroskop gezählt. Ergebnisse:
6 Monate EPO-Therapie hatte keine Effekte auf Körpergewicht
(KG), Blutzucker (BZ) und Glykohämoglobin (HbA1c) im Vergleich zu
den unbehandelten diabetischen Tieren (KG: N 570 € 52 g, D 384 € 36 g,
D+EPO 364 € 33 g; BZ: N 101 € 13 mg/dl, D 595 € 15 mg/dl, D+EPO
593 € 18 mg/dl; HbA1c: N 5,6 € 0,2%, D 12,0 € 2,1%, D+EPO 13,6 € 2,8%).
Nach 6 Monaten hatte die diabetische Gruppe 22% Perizytenverlust (D
vs. N, p < 0,0001), der durch EPO Behandlung um ~50% reduziert wurde
(D+EPO vs. D, p < 0,01). AZ wurden in der diabetischen Retina zweifach
vermehrt (D vs. N, p < 0,0001) und durch EPO Behandlung normaliziert