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durch die Kombination mit Adipokinen nachteilig auf den Metabolismus von SkMC wirken können. Zusätzlich zeigen sich deutliche Unterschiede zwischen PA und OA. Daher kann spekuliert werden, dass das Zusammenwirken von Fettsäuren und Adipokinen zumindest teilweise der Bildung ektoper Fettspeicher, deren lipotoxischen Effekten und somit der Adipositas-vermittelten Insulinresistenz zu Grunde liegen könnte. P277 Proline-rich Akt substrate of 40-kDa (PRAS40) schützt vor Palmitat-induzierter Insulinresistenz Wiza C 1 , Nascimento EBM 2 , Eckel J 1 , Ouwens DM 1 1 Deutsches Diabetes Zentrum Düsseldorf, Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie, Düsseldorf, Germany, 2 Karolinska Institut, Institut für Physiologie und Pharmakologie, Stockholm, Sweden Fragestellung: Veränderungen im Proteinkinase B (Akt)- und mTORC 1- (mammalian target of rapamycin Complex 1) Signalweg spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Insulinresistenz und Progression von Typ 2 Diabetes. Es konnte gezeigt werden, dass Prolin-rich Akt subtrate of 40kDa (PRAS 40), ein ursprünglich als Akt Substrat identifiziertes Protein, auch vom mTORC 1 phosphoryliert wird und darüber hinaus auch in der Lage ist, die mTORC 1-Aktivität zu regulieren. Somit dient PRAS 40 nicht nur als Substrat, sondern auch als Regulator des mTORC 1. Ziel dieses Projektes ist es, die Funktion von PRAS 40 hinsichtlich seiner Rolle im Insulinsignaling näher zu charakterisieren, basierend auf Versuchen unter insulinsensitiven Bedingungen und unter Palmitatinduzierter Insulinresistenz. Methodik: Mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems mit PRAS 40 spezifischer shRNA und PRAS 40 Überexpression wurde die PRAS 40 Expression in insulinsensitiven A14 Fibroblasten moduliert. Eine Insulinresistenz in den Zellen wurde durch Inkubation mit 0,75mM Palmitat für 18 h induziert. Zelllysate wurden anschließend zur Untersuchung der Expression und Phosphorylierung von Insulin-abhängigen Proteinen einer Western Blot Analyse unterzogen. Ergebnisse: Die Behandlung der A14 Fibroblasten mit Palmitat bei normaler PRAS 40-Expression reduzierte die Insulin-induzierte Phosphorylierung von Akt und führte außerdem zu einer verminderten IRS-1 Expression. Weder die Überexpression noch das Silencing von PRAS 40 besaß bei Abwesenheit von Palmitat einen signifikanten Effekt auf das Insulinsignaling. Inkubierte man die Zellen jedoch mit Palmitat, konnte nach PRAS 40-Silencing die Palmitat-induzierte Insulinresistenz verstärkt werden. Auf der anderen Seite konnte eine PRAS 40 Überexpression den negativen Effekt von Palmitat auf die IRS-1 Expression und Insulin-induzierten Akt-Phosphorylierung minimieren. Außerdem konnten wir innerhalb der PRAS 40 Proteinsequenz eine Kernexportsequenz (nuclear export sequence) identifizieren. Nach Überexpression einer PRAS 40-Mutante, die eine Mutation innerhalb der Kernexportsequenz trägt und somit verstärkt im Nukleus akkumuliert, konnte der protektive Effekt von PRAS 40 auf die Palmitat-induzierter IRS-1 Degradation und Reduktion der Akt- Phosphorylierung nicht mehr beobachtet werden. Schlussfolgerungen: Es konnte gezeigt werden, dass PRAS 40 einen protektiven Effekt auf die Palmitat-induzierte Insulinresistenz besitzt. Somit könnte PRAS 40 eine wichtige Rolle bei der Regulation des Insulintransduktionsweges spielen. Zusätzlich scheint eine zytosolische Lokalisation von PRAS 40 für diese Effekte essentiell zu sein. Postersitzung 29: Insulinwirkung P278 Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei der Entstehung eines Typ 2 Diabetes Schultz J 1 , Baltrusch S 1 1 Universität Rostock, Institut für Medizinische Biochemie und Molekularbiologie, Rostock, Germany Fragestellung: Mitochondrien bilden in der Zelle ein dynamisches tubuläres Netzwerk, welches durch sich abwechselnde Fusions- und Teilungsprozesse aufrechterhalten wird. Fusionsprozesse der Mitochondrien werden dabei durch das Protein Optic atrophy 1 (OPA1) und die Mitofusin homologen Proteine Mfn1 und Mfn2 vermittelt. Der mitochondriale Teilungsprozess wird durch das Dynamin-Related Protein1 (Drp1) und Fis1 reguliert. Dauerhafte morphologische Veränderungen des mitochondrialen Netzwerkes zeigen eine zelluläre Funktionsstörung auf. Es wird postuliert, dass eine solche Dysfunktion in den Langerhansschen Inseln des Pankreas vor allem in Gegenwart einer hohen Konzentration an freien Fettsäuren die Entstehung des Typ 2 Diabetes begünstigt. Daher war es das Ziel dieser Studie, die Mitochondriendynamik in Langerhansschen Inseln von adipösen ob/ob Mäusen zu untersuchen 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart und mit der der anderen Organe sowie normalgewichtiger Kontrollmäuse zu vergleichen. Methodik: Die Isolierung der Langerhansschen Inseln der adipösen ob/ob Mäuse (B6.V-lepob) und der normalgewichtigen Kontrolltiere (C 57BL/6 J) erfolgte durch Kollagenaseverdau. Den Tieren wurde zudem Leber, Muskel, Darm, Lunge, Fettgewebe und Gehirn entnommen. Aus den Geweben wurde RNA isoliert, cDNA generiert und die Genexpression von Fis1, Drp1, OPA1, Mfn1 und Mfn2 mithilfe der quantitativen Real-Time PCR untersucht. Mittels Western Blot und Immunfluoreszenz Analysen wurde die Expression auf Proteinebene analysiert. Ergebnisse: Die Genexpression von Fis1, Drp1, OPA1, Mfn1 und Mfn2 war in den Langerhansschen Inseln, sowie in den Geweben Leber, Muskel, Darm und Gehirn von adipösen ob/ob Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen signifikant, teilweise um bis zu 90% verringert. Hingegen zeigte die Lunge nur eine geringe nicht signifikante Expressionsabnahme und interessanterweise das in ob/ob Mäuse stark vermehrte Fettgewebe eine den Kontrollmäusen vergleichbare Expression. Während in Leber und Muskel der ob/ob Mäuse die Genexpression von Fis1, Drp1, OPA1, Mfn1 und Mfn2 im Vergleich zu Kontrolltieren gleichermaßen vermindert und die Proteinexpression von Fis1 um mehr als 50% reduziert war, zeigte sich in den Langerhanschen Inseln eine stärkere Expressionsreduktion der für die Fusion verantwortlichen Proteine Drp1, Mfn1 und Mfn2. Schlussfolgerung: Die Mitochondriendynamik ist in den Langerhansschen Inseln, sowie in Leber, Muskel, Darm und Gehirn der adipösen ob/ob Mäuse vermindert. Somit erfolgt die Eliminierung von funktionell beschädigten Mitochondrien durch Autophagie langsamer, was eine mitochondriale Dysfunktion und damit einen Typ 2 Diabetes begünstigen könnte. In den Langerhansschen Inseln kommt es zudem zu einem Ungleichgewicht von Fusions- und Teilungsprozessen, wodurch das mitochondriale Netzwerk hier stärker fragmentiert ist. Ob dies eine zelluläre Adaptation ist, die dauerhaft eine Funktionsstörung weiter begünstigt, gilt es zukünftig zu klären. P279 Proteomanalyse bei Skelettmuskelbiopsien von schlanken, adipösen und adipösen Probanden mit Diabetes Giebelstein J 1 , Dietrich JW 1 , Schechinger W 1 , Poschmann G 2 , Podwojski K 2 , Stühler K 2 , Meyer HE 2 , Levin K 3 , Beck- Nielsen H 3 , Hojlund K 3 , Klein HH 1 1 BG Universitätsklinikum Bergmannsheil, Med. Klinik I, Endokrinologische Forschung, Bochum, Germany, 2 Ruhr- Universität Bochum, Medizinisches Proteom Center, Bochum, Germany, 3 Universitetshospital Odense, Odense, Denmark Um Veränderungen auf Proteomebene zu detektieren, die zur Insulinresistenz bei Adipositas und/oder Typ-2 Diabetes beitragen könnten, wurden humane Biopsien des Musculus quadriceps, die vor und nach 180-minütiger Insulinstimulation (40mU/m 2 /min im glucose clamp) 10 schlanken (SCH; BMI 24,2 € 0,5), 11 adipösen nichtdiabetischen (AD, BMI 33,7 € 1,4) bzw. 10 adipösen Probanden mit Typ 2-Diabetes (ADD; BMI 33,5 € 1,1; HbA1c 7,3 € 0,4) entnommen wurden, einer Proteomanalyse zugeführt. Methode: Jeweils 50 mg Lysat der 62 Muskelproben wurde mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und mithilfe der differentiellen in-Gel Elektrophorese aufgetrennt und analysiert. Ein Pool aller Proben fand dabei als interner Standard Verwendung. Relevante Proteinspots wurden mit nano liquid chromatography electrospray ionization- MS/MS analysiert und die enthaltenen Proteine identifiziert. Ergebnisse: Von ca. 1600 in allen Gelen diskriminierbaren Spots wurden ca. 115 für die massenspektrometrische Analyse ausgewählt. Kriterien waren signifikant unterschiedliche Spotvolumina zwischen den Probandengruppen oder nach Insulinstimulation sowie signifikante Korrelationen mit klinischen Parametern. 13 Proteine (8 strukturell, 4 glykolytisch, 1 mitochondrial) wiesen in den basalen Biopsien signifikante Effekte > 1,5-fach zwischen AD und SCH auf, viel weniger Unterschiede wurden zwischen ADD und AD gefunden. Die 3-stündige Insulinstimulation führte nur bei wenigen Proteinen zu veränderter Expression. Mehrere identifizierte Proteine (u.a. GAPDH, PYGM, MYL-2) wurden in bis zu 8 unterschiedlichen Spots identifiziert, welches auf Unterschiede von posttranslationalen Proteinmodifikationen zwischen den untersuchten Gruppen hinweist. Bei einem Teil der gefundenen Proteine konnten mit massenspektrometrischen Analysen Phosphorylierungen und andere Modifikationen identifiziert werden. Ein großer Teil der identifizierten Spots wies signifikante Korrelationen mit Parametern wie Glukoseverschwinderate, nichtoxidativem Glukosemetabolismus, Lipidoxidation, BMI, oder Serum-Adiponektin auf. Während mehrere glykolytische Enzyme (GAPDH, Phosphoglyceratmutase, b- Enolase) negativ mit Glukoseverschwinderate und Glukoseoxidation korrelierten, waren mito- Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 S93
S94 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart chondriale Enzyme (u. a. ATP-Synthase Untereinheiten a und b) und Atmungskettenproteine (Malat- und Isocitratdehydrogenase) positiv mit Glukoseverschwinderate und nichtoxidativem Glukosestoffwechsel korreliert. Dies weist auf eine Rolle dieser Enzyme bei der Entstehung der Insulinresistenz hin. Schlussfolgerung: Die differentielle in-Gel Elektrophorese erlaubt die Identifikation bekannter und neuer Marker für Adipositas und Typ 2-Diabetes, allerdings werden nur Proteine detektiert, die ausreichend stark exprimiert sind. Insulinresistenz ist u.a. mit einer deutlich höheren Proteinexpression mehrerer glykolytischer und niedrigerer Proteinexpression mitochondrialer bzw. Atmungskettenenzymen im Muskel verbunden. P280 Hypoxie im Fettgewebe vermindert die TNFa-induzierte Aktivierung des NF-kB-Signalweges und führt zu einer geringeren basalen und TNFa-induzierten Sekretion der Chemokine MCP-1 und IL-8 Famulla S 1 , Cramer A 1 , Horrighs A 1 , Sell H 1 , Eckel J 1 1 Deutsches Diabetes-Zentrum, Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie, Düsseldorf, Germany Fragestellung: Das Auftreten von Hypoxie in expandierendem Fettgewebe als Folge einer Adipositas ist ein Phänomen, das sowohl im humanen Fettgewebe als auch im Tiermodell nachgewiesen werden konnte. Eine Hypoxie im Fettgewebe führt zu einer Aktivierung verschiedener Signalwege und einem veränderten Sekretionsprofil der Adipozyten. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss eines verminderten Sauerstoffangebotes auf den pro-inflammatorischen NF-kB Signalweg und die hieraus resultierenden Folgen auf der Ebene sekretorischer Zielgene von NF-kB zu untersuchen. Methodik: Primäre humane Adipozyten wurden unter Normoxie (21% O2) und einer starken Hypoxie (1% O2) für 8 – 48 Stunden inkubiert. Hierbei wurden sowohl konditionierte Medien (CM) als auch Zelllysate gewonnen, welche mittels ELISA bzw. Western-Blot-Analyse weiter untersucht wurden. Zur relativen Quantifizierung von mRNA Leveln wurde RNA normoxischer und hypoxischer Adipozyten isoliert und mittels quantitativer Real-Time PCR analysiert. Ergebnisse: Unter Hypoxie kommt es zu einer veränderten Sekretion verschiedener Adipokine. In CM primärer humaner Adipozyten lassen sich nach Konditionierung unter Hypoxie im Vergleich zur Konditionierung unter Normoxie höhere Mengen an IL-6, VEGF und Leptin, sowie eine verringerte Konzentration an Adiponektin und PEDF nachweisen. Ebenfalls kommt es zu einer verminderten Sekretion der Chemokine MCP-1 und IL-8, deren Expression durch den Transkriptionsfaktor NF-kB aktiviert werden. In diesem Zusammenhang haben wir das NF-kB Signaling in normoxischen und hypoxischen Adipozyten vergleichend untersucht. Bereits nach 8-stündiger Hypoxie zeigte sich eine verminderte Phosphorylierung von NF-kB und seines Inhibitors IkBa durch einen akuten TNFa-Stimulus im Vergleich zu normoxischen Zellen. Eine Langzeitstimulation mit TNFa über 18 Stunden führt zu einer signifikant verringerten Sekretion von MCP-1 (ca. 25% weniger) und IL-8 (ca. 20% weniger) unter Hypoxie. Parallel zu einer verminderten Sekretion nach TNFa-Stimulation unter Hypoxie wird auch die Expression von MCP-1 mRNA signifikant gehemmt. Desweiteren lassen sich sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene eine verminderte Expression des TNF-Rezeptor 1 nachweisen, was eine gestörte Signalweitergabe des TNFa-Stimulus bedeuten könnte und eine Ursache der verminderten Sekretion von MCP-1 und IL-8 darstellen würde. Schlussfolgerung: Unter Hypoxie kommt es zu Veränderungen im Sekretionsverhalten von humanen Adipozyten. Besonders auffällig ist hierbei die verminderte Freisetzung der Chemokine MCP-1 und IL-8 sowohl unstimuliert als auch nach TNFa- Stimulation. Der hierfür zu Grunde liegende Mechanismus ist in einer Hemmung des NF-kB-Signalings, insbesondere in einer verminderten Verfügbarkeit des TNF-Rezeptor 1 zu finden. Welche Rolle diese Effekte möglicherweise als Schutzmechanismus der Adipozyten gegen eine unkontrollierte autokrine Regulation von inflammatorischen Mediatoren spielen, bleibt zu klären. P281 Einfluss Insulinrezeptor-Substrat-1 vermittelter Signale auf die mitochondriale Funktion in vivo Stöhr O 1,2 , Leeser U 1,2 , Kleist-Retzow JC von 2,3 , Franko A 2,3 , Freude S 1,2 , Wiesner RJ 2,3 , Krone W 1,2 , Schubert M 1,2 1 Uniklinik Köln, Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin, Köln, Germany, 2 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK), Köln, Germany, 3 Uniklinik Köln, Institut für Vegetative Physiologie, Köln, Germany Einleitung: Bei der Regulation der Energiehomöostase kommt der Insulinrezeptor-Signaltransduktion eine bedeutende Rolle zu. Die Insulinrezeptor-Substrate (IRS) vermitteln die intrazellulären Effekte des Insulin- und Insulin-like growth factor-1 Rezeptors. IRS-1 defiziente Mäuse (IRS-1 Ÿ/Ÿ ) zeigen im Vergleich zu Wildtypgeschwistern neben einer Insulinresistenz einen Minderwuchs sowie eine vermehrte Futteraufnahme und eine reduzierte abdominelle Fettakkumulation bei gesteigertem Energieumsatz. Die molekulare Grundlage dieses gesteigerten Energieumsatzes ist unklar. Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine erhöhte Aktivität der mitochondrialen Atmungskette sein. Methoden: Zur Untersuchung der mitochondrialen Atmungskettenfunktion wurden Homogenate der insulinsensitiven Organe Leber und Muskel (musculus soleus, musculus gastrocnemius) und extrahierte Mitochondrien aus embryonalen Fibroblasten von IRS-1 Ÿ/Ÿ Mäusen und Wildtypgeschwistern photospektrometrisch bezüglich der Aktivität der einzelnen Komplexe der Atmungskette analysiert. Des Weiteren wurden Sauerstoffverbrauchsmessungen mittels Polarografie an Lebern von IRS-1 Ÿ/Ÿ Mäusen und Wildtypgeschwistern durchgeführt. Ergebnisse: Durch die Doppel- Wellenlänge Spektroskopie konnten bei IRS-1 Ÿ/Ÿ Tieren beiden Geschlechts im Vergleich zu Wildtypgeschwistern in weißer und roter Muskulatur keine Unterschiede bezüglich der Aktivität der mitochondrialen Atmungskette gezeigt werden. Auch in embryonalen Fibroblasten konnte keine Aktivitätsveränderung der Atmungskette zwischen den verschiedenen Genotypen detektiert werden. Die photospektrometrische Analyse der Leber zeigte ebenfalls keine Unterschiede bezüglich der Atmungskettenaktivität. In Real-time-PCR Analysen von weißem Fett konnte eine vermehrte Expression von UCP-1 in IRS-1 Ÿ/Ÿ Mäusen nachgewiesen werden. Polarografieuntersuchungen in Lebern IRS-1 defizienter Tiere zeigten eine geringere mitochondriale Koppelung in IRS-1 Ÿ/Ÿ Tieren verglichen mit Wildtypgeschwistern. Schlussfolgerung: Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse scheint nicht die erhöhte Aktivität der mitochondrialen Atmungskettenenzyme der zugrunde liegende Mechanismus des erhöhten Energieumsatzes in IRS-1 defizienten Tieren zu sein. Ursächlich scheint vielmehr die verstärkte Entkoppelung der mitochondrialen Atmungskette. P282 Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 Die Entwicklung Toll-like Rezeptor 4-abhängiger inflammatorischer Adipozytenfunktionen wird durch metabolische und immunologische Faktoren kontrolliert Reinbeck AL 1 , Gülden E 1 , Habich C 1 , Burkart V 1 1 Deutsches Diabetes-Zentrum, Institut für Klinische Diabetologie, Düsseldorf, Germany Fragestellung: Adipozyten und ihren Mediatoren werden zentrale Rollen bei der Entwicklung des chronisch-inflammatorischen Geschehens zugesprochen, das zu Adipositas-assoziierten Entzündungsreaktionen, Insulinresistenz und Diabetes beiträgt. Neuere Befunde zeigen, dass die inflammatorischen Aktivitäten der Adipozyten vom Toll-like Rezeptor 4 (TLR4), einem Rezeptor für inflammatorische Signale wie bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), kontrolliert werden. Aktuelle Beobachtungen lassen vermuten, dass die Ausprägung TLR4-abhängiger Adipozyten-Aktivitäten wesentlich von den Bedingungen abhängt, die während der Differenzierungsphase auf Adipozyten einwirken. Das Ziel der Studie war die Charakterisierung inflammatorischer und metabolischer Faktoren, die an der Entwicklung TLR4-abhängiger Adipozyten-Funktionen beteiligt sind. Methodik: Adipozyten der Linie 3T3-L 1 wurden in Gegenwart steigender Konzentrationen von LPS oder Glucose (Glc) zu reifen Adipozyten differenziert (9 Tage). Nach 7 Tagen Kultur in LPS-Abwesenheit bzw. in 1 g/l Glc wurde die TLR4-abhängige Aktivierbarkeit der ausgereiften Adipozyten durch Inkubation (24 h) mit LPS geprüft. Die LPS-stimulierte Freisetzung der proinflammatorischen Mediatoren Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) und Interleukin-6 (IL-6) wurde mittels ELISA quantifiziert. Ergebnisse: Die Differenzierung von Präadipozyten in Gegenwart des inflammatorischen Signals LPS (0, 1, 100 ng/ml) hatte keinen Einfluss auf die spontane Freisetzung von MCP-1 (14,4 € 1,4 ng/ml) oder IL-6 (0,2 € 0,1 ng/ml) durch ausgereifte Adipozyten. Es zeigten sich jedoch signifikante Effekte auf die LPS-indu-
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