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no alteration of Pomc neuron number at postnatal or pre-pubertal age. These data are consistent with a cell-autonomous role of InsR/FoxO1 in reducing POMC neuron number or silencing Pomc expression, distinct from the established role of InsR signaling in activating Pomc neuropeptide transcription through FoxO1 inhibition. Importantly, these changes in Pomc cells cannot be explained by changes in humoral factors or reciprocal changes in hypothalamic NPY neurons. Interestingly, aging is correlated with a decline in hypothalamic POMC neurons, as 30-weekold wild type mice exhibit 26% fewer Pomc-positive cells than 15-weekold mice. This aging-associated trimming of POMC neurons is not affected in L 1 or Pomc DFoxo1 mice. Thus, our data support the model that InsR/Foxo1 signaling acts as a cell-autonomous gauge of ambient insulin sensitivity to direct POMC neuronal development between puberty and young adulthood. P289 Der insulinabhängig-regulierte Transkriptionsfaktor Foxo1 beeinflusst die Mortalität in einem murinen Alzheimer-Modell Schilbach K 1,2 , Moll L 1,2 , Ernst M 2,3 , Wunderlich T 4,5 , Brüning JC 2,3,5 , Krone W 1,2,5 , Schubert M 1,2,5 1 Uniklinik Köln, Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin, Köln, Germany, 2 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK), Köln, Germany, 3 Institut für Genetik, Abteilung für Mausgenetik und Metabolismus, Köln, Germany, 4 Institut für Genetik, Abteilung für Mausgenetik und Adipositasassoziierte Tumorerkrankungen, Köln, Germany, 5 Universität zu Köln, Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), Köln, Germany Fragestellung: Störungen der Glukose-Homöostase und/oder der Insulinrezeptor/Insulin-like Growth Faktor-1 Rezeptor (IGF-1R) Signaltransduktion sind mit neurodegenerativen Erkrankungen wie beispielsweise M. Alzheimer (AD) assoziiert. Die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen sind jedoch unklar. Tg2576 Mäuse überexprimieren die schwedische Mutation des Amyloid-Precursor-Proteins und sind ein etabliertes Modell für AD. Diese Mäuse zeigen eine altersabhängige b-Amyloid-Akkumulation sowie eine deutlich verkürzte Lebensdauer. In eigenen Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass eine Neuronen-spezifische Deletion des IGF-1R in Tg2576 Mäusen diese vor ihrer vorzeitigen Mortalität schützt und die Amyloid-Akkumulation reduziert. Ein möglicher Kandidat für die Vermittlung des lebensverlängernden Effektes in IGF-1 resistenten Tg2576 Mäusen, ist der Transkriptionsfaktor Foxo1. Im vorliegen Projekt wurde daher der Einfluss Foxo1 mediierter Signale auf die Mortalität von Tg2576 Mäusen untersucht. Methodik: Es wurden zwei transgene Mauslinien etabliert. Die erste Mauslinie exprimiert Neuronen-spezifisch eine konstitutiv aktive Foxo1 Mutation (Foxo1ADA), die zweite eine dominant negative Variante von Foxo1 (Foxo1DN). Diese Mauslinien wurden mit Tg2576 Mäusen gekreuzt und charakterisiert. Ergebnisse: Sowohl die Foxo1DN als auch die Foxo1ADA Mäuse leben und erreichen ein Alter von mindestens 60 Wochen. Beide Mauslinien wurden bezüglich der Expression des Transgens untersucht. Die Expression der transgenen Konstrukte fand sich vor allem im Hippocampus (Gyrus dentatus, CA3, CA2 und schwächer in der CA1 Region). Vereinzelt fanden sich positive Neurone im frontalen und parietalen Cortex und im Cerebellum. Es zeigten sich keine strukturellen Pathologien in beiden transgenen Linien. Da sich eine Hyperglykämie auf die Alzheimer-typischen Pathologien in Mausmodellen auswirken kann, haben wir detaillierte Untersuchungen bezüglich des Glukosestoffwechsels durchgeführt. In beiden Mauslinien ergaben sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Blutzuckerkonzentrationen verglichen mit Wildtyp-Geschwistern. Ebenso zeigten sich keine Unterschiede in Glukose- und Insulintoleranztests. Daraufhin haben wir Foxo1DN und Foxo1ADA exprimierende Mäuse mit Tg2576 Mäusen gekreuzt und Wachstums- sowie Kaplan Meier-Kurven erstellt. Es zeigten sich keine Unterschiede bezüglich des Körpergewichtes zwischen den Tg2576 Mäusen und den Foxo1DNTg2576 oder Foxo1ADATg2576 Mäusen. Überraschenderweise sind jedoch nur Foxo1DN exprimierende Tg2576 Mäuse vor der vorzeitigen Mortalität geschützt, während die Foxo1ADA Mutante keinen Einfluss hat. Schlussfolgerung: Der Transkriptionsfaktor Foxo1 beeinflusst die Mortalität von Tg2576 Mäusen. Die beteiligten Foxo1-Zielgene müssen offensichtlich reprimiert werden um den lebensverlängernden Effekt zu vermitteln. Die Identifikation dieser beteiligten Foxo1-Zielgene wird Inhalt zukünftiger Untersuchungen sein. 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart P290 The lectin-like domain of thrombomodulin interferes with complement activation and protects against diabetic nephropathy Wang H 1 , Ilya V 1 , Zhou Q 1 ,HeT 1 , Thati M 1 , Shahzad K 1 , Kashif M 1 , Wolter J 1 , Bierhaus A 1 , Nawroth P 1 , Isermann B 1 1 University of Heidelberg, Department of Medicine I and Clinical Chemistry, Heidelberg, Germany Introduction: Thrombomodulin (TM) is predominantly a vascular endothelial cell plasma membrane glycoprotein that, via distinct structural domains, interacts with multiple ligands, thereby modulating coagulation, fibrinolysis, complement activation, inflammation and cell proliferation. We have previously shown that TM protects against diabetic nephropathy (DN) through activation of protein C(PC), which inhibits glomerular apoptosis. Recent studies showed that TM mediates cytoprotective effects independent of PC activation through it’s lectin-like domain (LLD). The LLD directly interferes with complement activation and protect against arthritis. DN is associated with an infiltration of inflammatory cells, enhanced cytokine production, and complement activation raising the question whether endothelial TM may protect against DN through a dual mechanism depenending on (a) PC activation and (b) complement inhibition through the LLD. Methods: DN was evaluated in mice with targeted deletion of the LLD of TM (TMLed/Led mice). Persistent hyperglycemia was induced using streptozotocin in TMLed/ Led mice and wild type mice (wt). Subgroups of mice were either anticoagulated (low molecular heparin (LMWH), fondaparinux) or treated with minocycline to inhibit glomerular apoptosis.. After 28 weeks albuminuria was determined and mice were sacrificed to isolated tissues for analyses. Results: Albuminuria, histological indices of DN and glomerular C 3 deposition increased in diabetic wt mice and further increased in diabetic TMLed/Led mice. Only treatment with LMWH, but not with fondaparinux corrected the aggravated DN in TMLed/Led mice, despite equal anticoagulation in both groups. Unlike fondparinux LMWH is also a potent inhibitor of complement activation. Indeed, we observed less complement deposits in LMWH treated diabetic TMLed/Led mice than in fondaparinux treated mice. In vitro, endothelial cells expressing a TM mutant lacking the LLD had diminished capacity to bind and inactivate C 3b and were thus sensitive to complement mediated cell lysis. Of note, apoptosis (TUNEL) and expression levels of apoptosis regulators (p53, Bax/Blc-2 ratio, Western) did no differ between untreated or LMWH/ fondaparinux treated diabetic TMLed/Led mice, indicating that the protective effect of LLD is independent of apoptosis inhibition. Consistently, inhibition of glomerular apoptosis with minocycline failed to normalize albuminuria in diabetic TMLed/Led mice. Discussion and conclusion: We identify a novel pathway through which endothelial TM protects against DN. TM protects against DN by inhibiting complement activation through its LLD. This function is independent of the recently identified activated PC dependent inhibition of glomerular apoptosis. Thus, endothelial TM prevents DN through two independent pathways. These results provide further experimental support for a causative role of endothelial dysfunction for DN. P291 Wirkung oraler Antidiabetika auf humane koronare Glattmuskelzellen Hinze AV 1,2 , Harst A 1 , Mayer P 1 , Kügelgen I von 2 1 Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, Pharmakologie und Toxikologie, Bonn, Germany, 2 Universität Bonn, Pharmakologie und Toxikologie, Bonn, Germany Fragestellung: Die Proliferation und Migration der humanen koronaren Glattmuskelzellen (HCASMCs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression von Arteriosklerose und der Entstehung von Stenosen sowie Restenosen nach vaskulärer Intervention. Zahlreiche Mediatoren und Pharmaka beeinflussen die Migration- und Proliferationsprozesse. In unserer aktuellen Studie haben wir die Wirkungen von oralen Antidiabetika auf das Proliferations- und Migrationsverhalten von kultivierten HCASMCs untersucht. Methodik: HCASMCs wurden kommerziell erworben und in dem vom Anbieter empfohlenen Medium kultiviert. Die Proliferationsversuche wurden in serumfreien Medium über fünf Tage durchgeführt. Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit dem Casy Counter. Im xCELLigence Real-Time Cell Analyzer wurde eine ¾nderung der Impedanz als Maß für Zellproliferation ermittelt. Vor Zugabe der Testsubstanzen wurden die Zellen 24 Stunden in serumfreiem Medium kultiviert. Zur Migrationsbestimmung wurden die HCASMCs auf 2-Kammer- Platten ausgesät und die Migrationsrate mittels der ¾nderung der Impedanz in der zweiten Kammer ermittelt. Die Expression früher Gene Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 S97
S98 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart wurde mittels Real-Time RT-PCR bestimmt. Ergebnisse: Zugabe des Sulfonylharnstoffs Glibenclamid (10 mM) verursachte eine markante (49%) Proliferationshemmung der HCASMCs. Durch Diazoxid (0,1 mM) wurde diese Proliferationshemmung aufgehoben. Rosiglitazon und Pioglitazon (jeweils in der Konzentration von 0,1 mM eingesetzt) führten zu einer vergleichsweise schwachen, durch T0070907 antagonisierbaren Proliferationshemmung. Die Dipeptidylpeptidase 4-Inhibitoren Vildagliptin und Sitagliptin verursachten ebenfalls eine schwache Hemmung des Zellwachstums. Auf die PDGF (Plättchen-abhängiger Wachstumsfaktor) induzierte Migration hatten Glibenclamid und Sitagliptin keinen signifikanten Effekt. Dagegen verurachte Pioglitazon eine Reduktion der Migrationsaktivität um 63%, und Vildagliptin steigerte die Migration um 102%. Alle getesteten Antidiabetika induzieren die Expression von frühen Genen (NR4A1, FOS, EGR 1, EGR3). Schlussfolgerung: Glibenclamid hemmte deutlich die Proliferation kultivierter koronarer Glattmusklezellen, hatte aber keinen signifikanten Einfluss auf die Migration. Eine schwache Hemmung der Proliferation bei gleichzeitig starker Erhöhung der Migrationsaktivität wurde von Vildagliptin ausgelöst. Letzteres könnte zur Progression einer Arteriosklerose beitragen. Alle getesteten Antidiabetika induzieren die Expression von frühen Genen. Der Effekt von Vildagliptin war hier am stärksten ausgeprägt. P292 Einfluss einer Hyperglykämie auf die Expression von Ubiquitin-E3-Ligasen MuRF-1/MAFbx und die Apoptoserate von Skelett- und Herzmuskelzellen, Einfluss von GLP-1-Analogon Liraglutid auf diese Prozesse an der Herzmuskelzelle Körner T 1 , Schönauer MFH 2 , Schuler G 1 , Adams V 1 1 Universität Leipzig Herzzentrum, Kardiologie, Leipzig, Germany, 2 Diabetes-Schwerpunktpraxis, Leipzig, Germany Einleitung: Klinische sowie tierexperimentelle Studien zeigten, dass eine diabetische Stoffwechsellage zu einer Muskelatrophie führen kann. Ein zentrales System beim Abbau von Muskelproteien ist das Ubiquitin- Proteasom-System mit seinen zwei spezifischen E3-Ligasen MuRF-1 und MAFbx. Fragestellung: Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer Hyperglykämie auf die Expression von MuRF-1 und MAFbx im Skelett- und Herzmuskel zeit- und konzentrationsabhängig zu untersuchen sowie die daraus folgende Auswirkung auf die Protein-Ubiquitylierung zu analysieren. Weiterhin stand die Beeinflussung der Apoptoserate im Fokus und ob das GLP-1-Analoga Liraglutid die Auswirkung am Herzmuskel beeinflussen kann. Methoden: Skelettmuskel Myotuben (differenzierte C 2C12-Skelettmuskelzellen) und neonatale Rattenkardiomyozyten wurden unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (5mM, 12mM, 25mM) für 24 oder 72 h ausgesetzt. Die Herzmuskelzellen wurden zusätzlich in den Glukosekonzentrationen unter Zusatz von 12 mg/ml Liraglutid für 72 h inkubiert. Die Expression der E3-Ligasen wurde mit qRT-PCR (MuRF-1 und MAFbx) und Western Blot (MuRF-1) quantifiziert. Die Poly-Ubiquitinylierung wurde mittels Western Blot bestimmt. Mittels Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics) wurde die Apoptoserate evaluiert. Ergebnisse: Die Inkubation von Herz- und Skelettmuskelzellen für 24 h mit hyperglykämischen Medium hatte keinen Einfluss auf die Expression von MuRF-1 und MAFbx sowie auf die Apoptoserate. Bei einer Inkubationszeit von 72 h konnten signifikante Erhöhungen bei 25mM Glukose für MuRF-1, MAFbx, Poly-Ubiquitinylierung und der Apoptoserate in Skelett- und Herzmuskelzellen festgestellt werden. Diese Anstiege konnten durch den Zusatz von Liraglutid beim Herzmuskel teilweise verhindert werden. Diskussion: Die Ergebnisse dieser Studie konnten zeigen, dass eine Hyperglykämie in der Zellkultur nach 72 h die Expression von zwei wichtigen Ubiquitin-E3-Ligasen sowie die Steigerung der Apoptoserate induzieren kann und dass dies durch Liraglutid am Herzmuskel teilweise verhindert werden kann. Diese Vorgänge können eventuell den Proteinverlust bzw. Muskelatrophie beim Diabetes zum Teil erklären. P293 Glyoxalase I knockdown induziert retinale Endothelzellschädigung unter milden hyperglykämischen Bedingungen Michel P 1 , vom Hagen F 1 , Bierhaus A 2 , Brownlee M 3 , Hammes HP 1 1 V. Med, Medizinische Fakultät Mannheim, Universität Heidelberg, Mannheim, Germany, 2 Endokrinologie, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg, Heidelberg, Germany, 3 Department of Medicine, Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, United States Hintergrund/Fragestellung: Die diabetische Retinopathie ist die häufigste mikrovaskuläre Komplikation des Diabetes und kann unbehandelt zur Erblindung führen. Hyperglykämie verstärkt die Akkumulation von advanced glycation endproducts (AGE). AGEs binden an den Rezeptor RAGE und induzieren die Expression inflammatorischer Zytokine. Dies führt zu einer Schädigung des Gefäßendothels. Der Verlust von Perizyten und die vermehrte Bildung von azellulären Kapillaren sind die frühen morphologischen Schädigungen des retinalen Kapillarsystems. Glyoxalase I baut das AGE Methylglyoxal ab. Wir untersuchten daher, wie sich der Knockdown von Glyoxalase I (GloIkd) auf die retinale Morphologie und die Expression von Wachstumsfaktoren unter normo- und hyperglykämischen Bedingungen auswirkt. Methodik: Bei nicht-diabetischen und diabetischen Wildtyp und GloIkd Mäusen wurde nach 8 Wochen und 4,5 Monaten die Endothel- und Perizytenzellzahl, sowie die Anzahl azellulärer Kapillaren in retinalen Digestionspräparaten bestimmt. Gliale Aktivierung wurde durch immunofluoreszenz Färbung überprüft. Nach 8 Wochen wurde die retinale Expression von 24 inflammatorischen- und Wachstums-Faktoren quantitativ untersucht. Ergebnisse: Die Endothelzellzahl in den diabetischen GloIkd Mäusen war gegenüber den nicht-diabetischen Tieren nach 4,5 Monaten reduziert (GloIkd diabetisch: 3266 € 134 Endothelzellen pro mm 2 Kapillarfläche, GloIkd nicht-diabetisch: 3519 € 136 Endothelzellen pro mm 2 Kapillarfläche). Die Anzahl der Perizyten war an beiden Zeitpunkten in allen Gruppen vergleichbar. Retinale Kapillardegeneration war sowohl in diabetischen Wildtypen, als auch in diabetischen GloIkd Mäusen an beiden Zeitpunkten nicht nachweisbar. Der gliale Marker GFAP färbte an beiden Zeitpunkten in allen Gruppen nur die Astrozyten an. Die retinale Genexpressionsanalyse zeigte eine um 46% reduzierte Expression von Glyoxalase I in den GloIkd Mäusen. Die VEGFA Expression war in diabetischen Wildtyp und diabetischen GloIkd Mäusen vermindert. Die Tie2 Expression war in diabetischen GloIkd Mäusen um 23% vermindert. Schlussfolgerung: In normoglykämischen Mäusen beeinflusste der genetische knockdown von Glyoxalase I die retinale Morphologie nicht. Die experimentell induzierte Hyperglykämie war nicht stark genug, um nach 4,5-monatiger Diabetesdauer eine retinale Schädigung in den Wildtypen zu induzieren. Trotz milder Hyperglykämie wiesen diabetische GloIkd Mäuse eine milde retinale Endothelzellschädigung auf, die jedoch nicht zur kapillären Degeneration führte. Die verminderte Expression von Tie2 lässt sich durch die reduzierte Endothelzellzahl begründen. Diese präliminären Daten deuten an, dass unter normoglykämischen Bedingungen der Glyoxalase I knockdown die retinale Morphologie nicht beeinflusst. In der diabetischen Retina könnte das Glyoxalase I System am retinalen Endothezellschaden mitbeteiligt sein. P294 Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 Kollagenfragmente im Urin werden signifikant durch Diabetes verändert: Eine Verbindung zur Pathophysiologie Schiffer E 1 , Maahs DM 2 , Mischak H 1,3 , Rossing P 4 , Siwy J 1 , Snell-Bergeon JK 2 1 Mosaiques Diagnostics GmbH, Hannover, Germany, 2 Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, Aurora, United States, 3 University of Glasgow, BHF Glasgow Cardiovascular Research Centre, Glasgow, United Kingdom, 4 Steno Diabetes Center, Gentofte, Denmark Fragestellung: Obwohl alle Formen des Diabetes mellitus (DM) durch Hyperglykämie und beta-Zelldysfunktion gekennzeichnet sind, ist die Pathogenese des DM vielschichtig und umfasst unterschiedliche Grade der beta-Zelldysfunktion, Apoptose, Entzündungsprozesse und Immunantwort. Die Proteomanalyse verspricht substantielle Einblicke in die pathopysiologischen Veränderungen, die mit unterschiedlichen Typen des DM assoziiert sind. Kürzlich haben wir Urin-Proteom Biomarker für Diabetes und dessen mikro- und makro- vaskulären Komplikationen identifiziert und validiert. Basierend auf diesen ersten Ergebnissen, war das Ziel dieser Studie, die identifizierten Urin-Proteom Biomarker für
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