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induziert wird. Sowohl in INS-1E Wildtypzellen als auch in primären
human Inseln wird ein starker p8 mRNA Peak nach 6 h beobachtet, der
nach 24 h auf fast normale Werte fällt. In einem C 57Bl/6 in vivo Modell
resultiert eine einmalige STZ Injektion (250 mg/g Körpergewicht) in einem
starken Anstiegs der Blutglucosewerte nach 6, 24 und 48 Stunden.
Ein Abfall auf fast normale Blutglucosewerte nach 12 h werden dabei
durch apoptotischer Betazellyse verursacht. Gestützt wird dies durch
die Beobachtung immunfluoreszenzgefärbter Pankreata. Innerhalb der
Verlaufsreihe war die Zahl TUNEL positiver Kerne (später Apoptosemarker)
nach 12 h maximal, während die p8 Fluoreszenzintensität nach
3 – 6 h ihren maximalen Wert aufwies. Abgesehen davon untersuchen
wir gegenwärtig den exakten zeitlichen Verlauf der p8 Expression durch
qPCR. Schlussfolgerung: Das Protein p8 besitzt gewebeschützende Eigenschaften
durch Inhibition von Apoptose. Es scheint p8 als Schalterprotein
zwischen proliferativen und apoptotischen Signalwegen innerhalb
von Betazellen zu fungieren.
P271
Expression und Regulation von Selenoprotein P
in pankreatischen Betazellen
Hotze AL 1,2 , Schinner S 1 , Speckmann B 2 , Mülders-
Opgenoorth B 1 , Pinto A 2 , Scherbaum WA 1 , Sies H 2 ,
Steinbrenner H 2
1 Uniklinik Düsseldorf, Endokrinologie, Düsseldorf, Germany,
2 Universität Düsseldorf, Institut für Biochemie &
Molekularbiologie I, Düsseldorf, Germany
Fragestellung: Schädigung durch oxidative Noxen gilt als ein Mechanismus
der Verringerung der Betazellmasse in der Pathogenese des Typ2
Diabetes mellitus. Betazellen gehören zu den am geringsten mit antioxidativen
Enzymen ausgestatteten Zellen: Die Enzymaktivitäten von Katalase
und Glutathionperoxidase in Betazellen betragen nur 1% der Werte
in Hepatozyten. Selenoprotein P (SeP) mRNA wurde innerhalb der
pankreatischen Inseln in den Betazellen detektiert. Neben seiner Hauptrolle
als Selentransporter ist SeP ebenfalls ein antioxidatives Enzym und
könnte am Schutz von Betazellen vor oxidativem Stress beteiligt sein.
Biosynthese und Funktion von SeP in Betazellen wurden bisher nicht
untersucht. Daher sollten in dieser Studie Faktoren identifiziert werden,
die die Transkription und Proteinexpression von Selenoprotein P in Betazellen
regulieren. Methodik: Als Modell für Betazellen diente die Ratten-Insulinom
Zelllinie INS-1, die bei 5, 11 oder 16,7mM Glucose selendefizient
bzw. supplementiert mit je 1 mM Selenit, Selenat oder Selenomethionin
für 24 h kultiviert wurde. Die Zellviabilität wurde mit dem
MTS-Assay (Promega) gesichert. Die Quantifizierung der SeP mRNA erfolgte
mittels real-time RT-PCR am LightCycler (Roche). Zum Nachweis
von SeP auf Proteinebene wurde ein Western Blot etabliert. Die Aktivität
des SeP-Promotors wurde nach transienter Transfektion mit einem SeP-
Reportergenkonstrukt mittels Dual Luciferase Assay (Promega) bestimmt.
Ergebnisse: Selenoprotein P ist in INS-1 Zellen hoch exprimiert.
Der relative SeP mRNA-Gehalt der INS-1 Zellen lag bei 12% des zum
Vergleich in Hepatozyten bestimmten Wertes. Im Unterschied zu Hepatozyten
sezernieren INS-1 Zellen SeP nicht, sondern exprimieren es als
intrazelluläres Protein mit einem Molekulargewicht von 51 kDa. Alle
eingesetzten Selenverbindungen induzierten eine leichte Erhöhung der
SeP-Expression. Unter hyperglykämischen Bedingungen waren Promotoraktivität,
mRNA- und Proteinexpression von Selenoprotein P in
INS-1 Zellen sowie in primären murinen Inseln erniedrigt. Wenn das
Kulturmedium der INS-1 Zellen mit Natriumselenat supplementiert war,
wurde SeP am stärksten durch hohe Glucosekonzentrationen inhibiert:
16,7mM Glucose führten zu einer im Vergleich zu 5mM Glucose
2,0 – 2,5fach niedrigeren SeP-Promotoraktivität und Expression
(p < 0,05). Schlussfolgerung: Selenoprotein P wird in pankreatischen
Betazellen auf mRNA- und Proteinebene exprimiert und durch Selenverbindungen
sowie Glucose reguliert. Diese Ergebnisse lassen eine Rolle
von SeP für den antioxidativen Schutz der Betazellen vermuten, die
Gegenstand zukünftiger Studien sein wird.
P272
Hemmung des beta-zellspezifischen
Transkriptionsfaktors MafA durch die Dual
Leucine Zipper Kinase
Oehmen MJ 1 , Dickel C 1 , Blume R 1 , Oetjen E 1
1
Universitätsmedizin Göttingen, Pharmakologie, Göttingen,
Germany
Fragestellung: Die Insulinbiosynthese ist eine wichtige Funktion der
Beta-Zelle, und eine unangemessene Insulinsekretion und -produktion
resultieren in Diabetes mellitus. Unsere früheren Untersuchungen zeig-
45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart
ten die Induktion von Beta-Zellapoptose durch die dual leucine zipper
kinase DLK. In der jetzigen Studie wurde die Wirkung der DLK auf die
Insulingentranskription untersucht. Methodik: Transiente Transfektionen
und Reportergenassays in der Insulin produzierenden Beta-Zelllinie
HIT und in der heterologen Zelllinie JEG, Immunoblot. Ergebnisse: Die
Reduktion der endogenen DLK in HIT Zellen durch small interference
RNA stimulierte die Transkription des humanen Insulingens dreifach.
Übereinstimmend damit hemmte die Überexpression der DLK, aber
nicht ihrer Kinase-toten Mutante die Insulingentranskription. In 5’und
3’-Promotordeletionsanalysen wurde die DNA-Bindungsstelle für
MafA als DLK-responsives Element identifiziert, und die Aktivität vermittelt
durch die MafA Transaktivierungsdomäne wurde durch DLK gehemmt.
In der Nicht-Beta-Zelllinie JEG reduzierte DLK ebenfalls die
durch MafA stimulierte Insulingentranskription. Um die zugrunde liegenden
molekularen Mechanismen zu untersuchen, wurde die Wirkung
von DLK auf die Proteinstabilität von MafA in JEG Zellen untersucht.
Abhängig von ihrer enzymatischen Aktivität verminderte DLK die MafA
Proteinmenge um 40%. Zusätzliche Inkubation mit einem Hemmstoff
der der DLK untergeordneten Kinase JNK hob die DLK induzierte MafA
Degradation auf. Schlussfolgerung: Unsere Daten lassen vermuten, dass
die DLK durch Aktivierung ihrer untergeordneten Kinase JNK zu einer
Degradation von MafA und dadurch zu einer Hemmung der Insulingentranskription
führt. Der beta-zellspezifische Transkriptionsfaktor MafA
stellt somit ein weiteres Ziel der DLK Wirkung dar. In Anbetracht der
Bedeutung von MafA für die Aufrechterhaltung der Beta-Zellfunktion,
könnte die Hemmung von DLK zu der Aufrechterhaltung der MafA-abhängigen
Beta-Zellfunktion beitragen.
P273
Fluoreszenzmikroskopische Echtzeitanalyse der
glucoseinduzierten Insulinsekretion in
Beta-Zellen der Maus
Kaminski MT 1 , Lenzen S 1 , Baltrusch S 1,2
1 Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische
Biochemie, Hannover, Germany, 2 Universität Rostock,
Institut für Medizinische Biochemie und Molekularbiologie,
Hannover, Germany
Fragestellung: Das Signal für die bedarfsgerechte Insulinsekretion aus
den Beta-Zellen des Pankreas wird im Glucosestoffwechsel generiert.
Dabei spielt die Glucoseaufnahme durch den Glucosetransporter GLUT2
und die Phosphorylierung der Glucose durch die Glucokinase eine wesentliche
Rolle. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ist
letztlich entscheidend für die Exozytose der Insulingranula. Die Veränderung
der intrazellulären Glucosekonzentration kann durch das fluorescence
resonance energy transfer-(FRET)-Sensorkonstrukt FLIPglu in
Echtzeit verfolgt werden. Eine zeitliche Korrelation zwischen dem Glucosestimulus
und der Insulinsekretion in Beta-Zellen ist bislang noch
nicht gelungen. Es war daher das Ziel dieser Studie, die intrazelluläre
Glucosehomöostase parallel zum Calciumflux und der Insulinsekretion
in Beta-Zellen zu charakterisieren. Methodik: Inselzellen wurden durch
Kollagenaseverdau aus dem Pankreas von NMRI Mäusen isoliert und
vereinzelt. Der Glucosesensor FLIPglu wurde durch adenovirale Transduktion
exprimiert. Des Weiteren wurde eine stabil FLIPglu überexprimierende
insulinsezernierende MIN6-Zelllinie verwendet. Die Zellen
wurden mit Fura-2 beladen, mit Krebs-Ringer-Puffer für 40 min in Abwesenheit
von Glucose umströmt und dann mit 10 mM Glucose für
20 min stimuliert. Die Veränderung der intrazellulären Glucosekonzentration
mittels FLIPglu und die der [Ca 2+ ]i Konzentration mittels Fura-2
wurden zeitgleich fluoreszenzmikroskopisch bestimmt. Der Insulingehalt
wurde im Umströmungsmedium mittels ELISA analysiert. Ergebnisse:
Der Anstieg der FRET-Effizienz des FLIPglu Sensors charakterisierte
die Glucoseaufnahme der Zelle nach Stimulierung und die Abnahme
nach Glucoseentzug die Glucosephosphorylierungsrate. Dabei war die
Glucoseaufnahme in primären Beta-Zellen signifikant höher als in
MIN6-Zellen, die Phosphorylierungsrate jedoch gleich. Dem Anstieg
der intrazellulären Glucosekonzentration folgten in MIN6-Zellen mit einer
zeitlichen Verzögerung von 60 sek [Ca 2+ ]i Oszillationen, begleitet
von einer Erhöhung der Insulinfreisetzung in das Umströmungsmedium.
In Gegenwart von 10 mM 3-O-Methylglucose war das Einsetzen der
[Ca 2+ ] i Oszillationen um weitere 60 sek verzögert. Die Anwesenheit
von 10 mM Mannoheptulose während der Stimulierung mit 10 mM
Glucose verminderte die [Ca 2+ ]i Oszillationen sowie die Insulinsekretion
signifikant. Schlussfolgerung: Eine fluoreszenzmikroskopische Echtzeitanalyse
des Glucosemetabolismus und des Calciumfluxes ist durch
den parallelen Einsatz des FRET-Konstruktes FLIPglu und Fura-2 möglich.
Durch Einsatz von Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass eine
Verlangsamung der Glucoseaufnahme primär zu einer Verzögerung der
Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002
S91