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notyp, charakterisiert durch erhöhte Nüchternblutglukose, leicht verminderte Nüchterinsulinspiegel, gestörte Glukosetoleranz und signifikant reduzierte glukose-induzierte Insulinsekretion, wohingegen die Insulinsensitivität nur bei weiblichen Mutanten in einem Alter von 6 Monaten eingeschränkt war. Homozygote Mutanten entwickelten einen früh einsetzenden schweren, ab einem Alter von 21 Tagen stabilen diabetischen Phänotyp und eine geringgradige Wachstumsverzögerung. Die Überlebensdauer homozygoter Mutanten war trotz hochgradiger Hyperglykämie nicht eingeschränkt. Quantitativ-stereologische Untersuchungen des endokrinen Pankreas ergaben bei männlichen heterozygoten Munich Gck D217V Mutanten in einem Alter von 18 Monaten ein unverändertes, bei homozygoten Mutanten hingegen ein um ~50% gegenüber Wildtyp-Kontrolltieren reduziertes Gesamtinsel- und Gesamtbetazellvolumen. Ebenso war die Volumendichte der b-Zellen in den Inseln bei diesen Tieren signifikant reduziert. Schlussfolgerungen: In Anbetracht des Mangels an lebensfähigen Mausmodellen für GCK- PNDM und der weitgehend unbekannten Pathomorphologie von MODY 2/PNDM stellt die Munich Gck D217V Mutante ein geeignetes Modell für Langzeitstudien zur Untersuchung humanmedizinisch relevanter Aspekte von MODY 2 und PNDM dar. P265 Comparison of regulatory effects of GLP-1 metabolite (9 – 36) amide with GLP-1 (7 – 36) amide during IVGTT in rats Berg S 1 , Heinke P 1 , Salzsieder E 1 , Kohnert KD 1 , Freyse EJ 1 1 Institut für Diabetes „Gerhardt Katsch“ Karlsburg, Karlsburg, Germany Aims: Studies in man and pig have shown that GLP-1 (9 – 36) amide (GLP-1 m) is a glucoregulatory peptide, but its insulinotropic actions are not yet fully investigated. We developed a simple test to differentiate the insulinotropic and glucoregulatory effects of incretins and characterized the incretin effects of GLP-1 m in comparison to those of active GLP-1 (7 – 36) amide (GLP-1a) in more detail. Methods: Catheterized, conscious Wistar rats were injected with vehicle (V; 0.1% bovine serum albumin in saline), 4.0 nmol/kg GLP-1 m, 4.0 nmol/kg GLP-1a and 4.0 nmol/kg GLP-1 m+4.0 nmol/kg GLP-1a in paired experiments. Incretins or vehicle were injected at Ÿ 5 min prior to the IVGTT (0.4 g glucose/kg) at 0 min. Arterial blood was drawn for blood glucose (G) and plasma insulin (I) determination (Ÿ 5, 0 min and at 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20 min). Absolute G- and I- AUC0 – 20 min, insulinogenic Index iI (quotient of insulin and blood glucose area (mg/mmol)), apparent glucose distribution space GDS (ml/kg) and glucose efflux KG (%/min) were calculated from IVGTT data. The paired two-tailed t-test with Bonferroni-Holm correction was used for comparison between treatment groups and controls. Within-group changes were tested by t-test. Results: None of the tests procedures affected blood glucose levels in the 5 min period before IVGTT, but Insulin was increased early after GLP-1a and GLP-1a+GLP- 1 m, respectively. The incretins had no significant effects on glucose tolerance (G-AUC; V: 162 € 19, GLP-1 m: 166 € 8, GLP-1a: 150 € 18, GLP- 1a+GLP-1 m: 150 € 17mmol·min/L; NS). GLP-1 m increased GDS (V: 205 € 12, GLP-1 m: 248 € 19, GLP-1a: 222 € 10, GLP-1a+GLP-1 m: 214 € 25 mL/kg) and lowered concomitantly glucose efflux when administered alone (KG; V: 13.9 € 1.0, GLP-1 m: 9.4 € 1.1*, GLP-1a: 15.1 € 2.4, GLP-1a+GLP-1 m: 14.8 € 2.2%/min). Both peptides GLP-1a and GLP-1 m exerted an insulin stimulatory effect during IVGTT (I-AUC; V: 43 € 7, GLP-1 m: 67 € 17, GLP-1a: 134 € 50*, GLP-1a+GLP-1 m: 140 € 48* ng·min/L). Moreover, GLP-1 m had a measurable increasing effect on insulinogenic Index, about half those of intact GLP-1a (iI; V: 0.27 € 0.04, GLP-1 m: 0.40 € 0.09, GLP-1a: 0.93 € 0.47, GLP-1a+GLP-1 m: 0.97 € 46 mg/mmol). Conclusions: The results show that GLP-1 m exerts an incretin effect, by increasing significantly the insulinogenic Index. Thus GLP-1 m, might contribute to the observed incretin effect after GLP-1a secretion under physiological conditions. It is hypothesized, that systemic DPP-4 inhibition masks some incretin effects of GLP-1 m with the consequence of lowering the insulinogenic Index. This has to be investigated in a supplementary study. 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart P266 Charakterisierung der DMT1-Eisentransporterexpression in insulinproduzierenden Zellen Lortz S 1 , Lenzen S 1 1 Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Biochemie, Hannover, Germany Fragestellung: Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) kommt bei der selektiven Zerstörung von insulinsezernierenden b-Zellen in der Pathogenese des Typ 1 Diabetes mellitus eine entscheidende Rolle zu. Durch den geringen antioxidativen Schutz von b-Zellen kommt es unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen primär zur Bildung von Superoxidradikalen und Wasserstoffperoxid. Diese können dann sekundär in der Eisen-katalysierten Fenton-Reaktion weiter zu den stark toxischen und höchst reaktiven Hydroxylradikalen reagieren. Daher war das Ziel dieser Studie, die Expression der DMT1-Eisentransporter-Isoformen in insulinproduzierenden Zellen und primären Inseln der Ratte zu quantifizieren und den Einfluss von Zytokinen auf ihre Expression zu charakterisieren. Methodik: Die Genexpression der vier bekannten DMT1-Eisentransporter-Isoformen wurde mittels quantitativer RT-PCR in insulinproduzierenden Zellen (RINm5F- und INS-1E-Zellen), primären Inseln der Ratte und zum Vergleich in neuroendokrinen PC 12-Zellen spezifisch quantifiziert. Zusätzlich wurde die DMT1-Expression nach Inkubation mit IL-1b oder einem Zytokinmix (IL-1b, TNF-a und IFN-g) bestimmt. Ergebnisse: RINm5F-und INS-1E-Zellen zeigten im Vergleich zu primären Inselzellen ein nahezu übereinstimmendes Expressionsmuster der DMT1 Isoformen 1A und 1B (Varianten im 5’-Bereich der mRNA) sowie der Varianten +IRE und -IRE (Varianten im 3’-Bereich der mRNA mit bzw. ohne Iron Responsive Element). Dabei zeigte sich, dass die Isoform 1A mit < 1% der DMT1-Gesamtexpression am geringsten exprimiert war, während bei den neuroendokrinen PC12-Zellen die Expression der 1A-Isoform ca. 40% der DMT1-Gesamtexpression betrug. IL-1b und der Zytokinmix führten zu einer signifikanten Induktion aller DMT1-Isoformen. Aufgrund der niedrigen DMT1 – 1A Expression unter Kontrollbedingungen zeigten sich hier mit einer ca. 6-fachen (IL-1b) bis 12-fachen (Zytokinmix) Induktion die größten Unterschiede. Alle anderen Isoformen sowie die DMT1-Gesamtexpresssion zeigten einen zwei- bis dreifachen Expressionsanstieg. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse zeigen, dass b-zelltoxische Zytokine die DMT1-Genexpression signifikant induzieren. Durch den gesteigerten Import von Eisen könnte dies zu einer Erhöhung der intrazellulären Eisenkonzentration und zu einer vermehrten Bildung von Hydroxyradikalen mittels Eisen-katalysierter Fentonreaktion führen. Daher ermöglicht die Charakterisierung der DMT1-Eisentransporterexpression sowie deren Induktion durch b-zelltoxische Zytokine in insulinproduzierenden Zellen, ein besseres Verständnis des molekularen Zerstörungsmechanismus von pankreatischen ß-Zellen im Verlauf der Typ 1 Diabetesmanifestation. Insbesondere die Inhibierung der durch Eisen katalysierten Generierung von Hydroxylradikalen könnte ein möglicher Ansatzpunkt für die Verhinderung der zytokinvermittelten b-Zellzerstörung im Autoimmundiabetes sein. P267 Mimitin Überexpression schützt gegenüber Zytokin-induzierter Apoptose durch Unterdrückung der MAP1S Wirkung Hanzelka K 1 , Lenzen S 1 , Gurgul-Convey E 1 1 Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Biochemie, Hannover, Germany Fragestellung: Mimitin ist ein mitochondriales Protein, welches in insulinproduzierenden Zellen durch Zytokine induziert wird. Es wurde in anderen Zellarten beobachtet, dass Mimitin mit MAP1S interagieren kann. MAP1S ist ein proapoptotisches zytoplasmatisches Protein, das eine bis jetzt ungeklärte Rolle bei der ER Stress Entwicklung spielt. Das Ziel dieser Untersuchung war es, die Interaktion zwischen Mimitin und MAP1S in insulin-produzierenden Zellen nachzuprüfen und den Einfluss einer Mimitin Überexpression auf die Zytokin-induzierte Apoptose zu klären. Methodik: Insulin-produzierende INS1E Zellen wurden stabil transfiziert (Kontrollzellen INS 1E-pcDNA3, INS 1E-hMim mit humanem Mimitin). Die Zellen wurden mit IL-1b 600 U/ml oder mit einem Zytokinmix (IL-1b 60 U/ml, TNFa 185 U/ml und IFNg 14 U/ml) 24 h inkubiert. Die folgenden Methoden wurden benutzt: RNA Isolierung nach Chomczynski, Real-Time PCR, SEAP Reporter Genassay, MTT Assay, Proliferationassay, Griess Assay, Fluoreszenzmikroskopie. Ergebnisse: Die Analyse von Mimitin und MAP1S in insulin-produzierenden Zellen nach einer transienten Transfektion mit fluoreszierenden Konstrukten zeigte, dass Mimitin in Mitochondrien und MAP1S im Zytoplasma lokalisiert ist. Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Zytokinen wurde beobach- Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 S89
S90 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart tet, dass Mimitin sich aus den Mitochondrien in das Zytoplasma bewegte und dort mit MAP1S interagiert. Mimitin-Überexpression schützte die INS 1E Zellen deutlich gegenüber Zytokintoxizität (MTT Assay nach 24 Stunden: INS 1E pcDNA3 IL-1b 51 € 6, Zytokinmix 37 € 5 vs. INS 1E-hMim IL-1b 96 € 1, Zytokinmix 79 € 3%). Auch die Proliferationrate war bei INS 1E-hMim Zellen nach einer 24 h Inkubation mit Zytokinen deutlich höher als bei Kontrollzellen (INS 1E pcDNA3 IL-1b 58%, Zytokinmix 28% vs. INS 1E-hMimitin IL-1b 85%, Zytokinmix 53%). Die durch Zytokine induzierte Caspase-3 Aktivierung wurde vollständig in INS 1E-hMim Zellen aufgehoben (24 h, INS 1E: IL-1b 175 € 24, Zytokinmix 210 € 52; INS1E-hMim: IL-1b 112 € 13, Zytokinmix 88 € 10%). Die Aktivierung von mitochondrialer Caspase-9 wurde durch Mimitin Überexpression auch beeinflusst (24 h, INS1E: IL-1b 177 € 13, Zytokinmix 172 € 19; INS1E-hMim: IL-1b 122 € 7, Zytokinmix 150 € 12%). Interessanterweise wurden Caspase-8, die den extrinsischen apoptotischen Pathway auslöst, und auch Caspase-12, die mit ER Stress in Verbindung gebracht wird, gehemmt (Caspase-8 nach 24 h, INS 1E: IL-1b 234 € 11, Zytokinmix 168 € 6; INS 1E-hMim IL-1b 111 € 13, Zytokinmix 143 € 12%; Caspase-12, INS1E: IL-1b 140 € 19, Zytokinmix 191 € 26; INS1E-hMim: IL-1b 101 € 10, Zytokinmix 116 € 15%). Es wurden keine signifikanten Effekte der Mimitin Überexpression auf den NFkB-iNOS Pathway beobachtet. Schlussfolgerungen: Somit schützt Mimitin insulinproduzierende Zellen gegenüber Zytokintoxizität durch Unterdrückung der MAP1S Wirkung. P268 Die Bedeutung des peroxisomalen Fettsäurestoffwechsels für die Lipotoxizität in insulinproduzierenden Zellen Gehrmann W 1 , Würdemann W 1 , Elsner M 1 , Lenzen S 1 1 Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Biochemie, Hannover, Germany Fragestellung: Erhöhte Konzentrationen langkettiger gesättigter Fettsäuren können beim T2DM zu einer b-Zell-Dysfunktion und -Apoptose führen, wohingegen ungesättigte Fettsäuren einen protektiven Effekt haben. Langkettige Fettsäuren können sowohl in den Mitochondrien als auch in den Peroxisomen metabolisiert werden. Während in den Mitochondrien ATP gebildet wird, entsteht als Produkt der b-Oxidation in den Peroxisomen H2O2. Dab-Zellen nur über eine geringe Expression an Katalase verfügen, sind sie besonders empfindlich gegenüber der vermehrten Bildung an H2O2. Daher war es Ziel dieser Studie, die Bildung von H2O2 in den Peroxisomen zu untersuchen, sowie den kettenlängenabhängigen protektiven Effekt von ungesättigten Fettsäuren und die Aktivierung verschiedener kompartimentspezifischer Initiator-Caspasen zu analysieren. Methodik: Die Zellvitalität von insulinproduzierenden RINm5F-Zellen wurde nach 24-stündiger Inkubation mit verschiedenen Fettsäuren im MTT-Assay bestimmt. Die Aktivierung von Caspase-8, -9 und -12 wurde nach 12, 18 und 24-stündiger Inkubation mit 100 mM Palmitinsäure in einem FACS-basierten Assay ermittelt. Das Fluoreszenzprotein HyPer, das eine intrazelluläre H2O2-Konzentrations- Messung ermöglicht, wurde spezifisch in den Peroxisomen von Katalase überexprimierenden RINm5F-Zellen überexprimiert. Die ¾nderungen der H2O2-Konzentration nach Palmitinsäureinkubation wurden mit einem Mikrotiterplatten-Fluorometer detektiert. Ergebnisse: Der protektive Effekt von einfach ungesättigten Fettsäuren gegenüber Palmitinsäure-induzierter Toxizität war abhängig von deren Kettenlänge. Während Ölsäure (C18:1) und Palmitoleinsäure (C 16:1) einen ausgeprägten protektiven Effekt aufwiesen, vermittelten Myristoleinsäure (C 14:1) und Dodecensäure (C 12:1) keinen deutlichen Schutz mehr. Die Todesrezeptor-spezifische Caspase-8, sowie die mitochondriale Caspase-9 und die ER-spezifische Caspase-12 waren nach 18-stündiger Palmitinsäureinkubation signifikant um 10 – 15% im Vergleich zur Kontrolle aktiviert mit einer verstärkten Aktivierung nach 24 h. Zwischen der Aktivierung der unterschiedlichen Caspasen gab es zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede. Die H2O2-Konzentration, die mithilfe des HyPer-Proteins gemessen werden konnte, war infolge einer 24-stündigen Palmitinsäureinkubation signifikant erhöht. Durch eine zusätzliche Überepression von Katalase in Peroxisomen konnte dieser Anstieg signifikant reduziert werden, wohingegen eine Überexpression von Katalase in den Mitrochondrien keinen protektiven Effekt hatte. Schlussfolgerungen: Das die analysierten Initiator-Caspasen gleichermaßen durch Palmitinsäure aktiviert wurden, deutet auf einen gemeinsamen aktivierenden Faktor hin. Durch das HyPer-Protein konnte gezeigt werden, dass es sich dabei vermutlich um peroxisomal gebildetes H2O2 handelt. Auch der kettenlängenabhängige protektive Effekt ungesättigter Fettsäuren deutet auf eine Beteiligung des peroxisomalen Fettsäure-Metabolismus bei der Lipotoxizität hin. Postersitzung 28: Insulinsekretion, Insulinwirkung P269 Akute und Chronische Effekte von Wnt-Stimulation auf pankreatische beta-Zellen – Regulation durch Exendin-4 Heller C 1 , Kühn MC 1 , Ülgen F 1 , Scherbaum WA 1 , Schinner S 1 1 Uniklinik Düsseldorf, Endokrinologie, Düsseldorf, Germany Fragestellung: Akute Wnt-Stimulation induziert eine Proliferation von beta-Zellen. Die Wirkung chronischer Wnt-Stimulation ist in beta-Zellen nicht untersucht. Klotho, ein Regulator zellulären Alterns, ist als extrazellulärer Wnt-Antagonist identifiziert worden. Die Regulation der Expression von Wnt-Signalmolekülen und von Klotho durch metabolische und pharmakologische Stimuli in beta-Zellen ist nicht bekannt. Deshalb haben wir die Wirkung chronischer Wnt-Stimulation, die Bedeutung von Klotho und deren Regulation in pankreatischen beta-Zellen untersucht. Methodik: Transiente Transfektionen mit in Ins-1 beta-Zellen. Isolierung, Kultivierung, mRNA und Protein Extraktion primärer muriner Inselzellen. Expressionsanalyse auf mRNA Ebene (PCR) und Proteinebene (Western Blot). Proliferationsassays (3 H-thymidine uptake). Immunhistochemie von Pankreata von wildtyp und NZO (New-Zealand Obese) Mäusen. Ergebnisse: Klotho und Wnt4 Expression wurden in primären murinen beta-Zellen detektiert (mRNA und Protein). Die Expression von Wnt-Signalmolekülen wurde in vitro nicht durch Glucose (5,5mM, 11mM, 16,7mM), Insulin (10 mM), Tolbutamid (100 mM), Rosiglitazone (100nM) oder Metformin (500 mM) in insulin-produzierenden Zellen reguliert. Das GLP-1 Analogon Exendin-4 (10nM) führte aber zu einem zweifachen (p < 0,001) Anstieg der Wnt4 mRNA Expression. Wnt4 wurde in einem adipösen Mausmodell (NZO) in pankreatischen Inseln verstärkt exprimiert, während die Expression von Klotho in NZO im Vergleich zu Kontrolltieren vermindert war. Funktionell fanden wir, dass Klotho die Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs durch Wnt3a in beta-Zellen antagonisiert. Im Gegensatz zur akuten Wnt-Stimulation hemmte eine chronische (7 d) Behandlung mit Wnt3a die Proliferation primärer beta-Zellen um 46% (p < 0,05). Ebenso wurde die Proliferation von Ins-1 Zellen unter chronischer Wnt-Stimulation (nach 35 d) deutlich auf 18% der unbehandelten Kontrolle gehemmt (p < 0,05). Diese Hemmung konnte durch Co-Stimulation mit Klotho wieder aufgehoben werden und es wurde eine Re-Induktion der Proliferation auf 136% (p < 0,05) erreicht. Schlussfolgerung: Diese Daten zeigen die Expression von endogenen Wnts und Klotho in pankreatischen beta-Zellen. Die Expression von Wnt4 und Klotho sind in einem adipösen Mausmodell (NZO) gegenläufig reguliert. Klotho hebt die Hemmung der Proliferation unter chronischer Wnt-Stimulation wieder auf, was der Wnt-Klotho Interaktion eine Bedeutung bei der Regulation der beta-Zell Proliferation zuweist. Wnt4 wird nach exendin-4 verstärkt exprimiert, was eine weitere Interaktion des Wnt-Signalwegs mit dem Inkretinsystem in beta- Zellen darstellt. P270 Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002 Das Protein p8 wird akut und temporär in STZ geschädigten Betazellen hochreguliert und verhindert Apoptose durch Inhibition der Caspasen 3 und 7 Pilz IH 1 , Päth G 1 , Tsaroucha E 1 , Dufner B 1 , van Loosen S 1 , Alt M 1 , Hopt UT 2 , Seufert J 1 1 Innere Medizin II/Universitätsklinikum Freiburg, Endokrinologie Diabetologie, Freiburg, Germany, 2 Chirurgische Klinik/Universitätsklinikum Freiburg, Allgemein und Viszeralchirurgie, Freiburg, Germany Fragestellung: Im exokrinen Pankreas induziert eine Pankreatitis die Expression des Protein p8 und schützt damit exokrines Gewebe vor Entzündungsschäden. Eigene Vorarbeiten bestimmten p8 als einen glucoseabhängigen Mediator endokriner pankreatischer Betazellproliferation. Anfängliche Daten zeigten einen reduzierten Streptozotozin (STZ) induzierten diabetogenen Schaden in transient p8 überexprimierenden INS-1 Betazellen. Dies äußerte sich in einer durch Annexin V FACS Analyse ermittelten reduzierten Apoptoserate. Resultate: Inzwischen analysierten wir die Rolle stabiler p8 Expression in vitro. Stabile p8- INS-1E Zellen weisen erhöhte basale Viabilität und signifikant erhöhte Zellzahlen nach 5-tägiger Kultur gegenüber Zellen mit Vektorkontrollen (Mock) auf. Bei 0 – 1 mM STZ Schädigung (LD 50 = 0,66 mM) reduziert p8 Überxpression signifikant die Aktivierung der Apoptoseeffektoren Caspase 3 und 7 um 50 – 65% nach 8 h. Nach 24 h ist die Caspase 3/7 Aktivierung noch um 25 – 29% reduziert, womit dies auf einen Schutz durch p8 während akuter Gewebeschädigung hinweist. Dies korreliert mit unserer Beobachtung, dass die p8 mRNA Expression dosisabhängig durch STZ
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