Download Abstractbuch (Freie Vorträge und Poster)

S90 45. Jahrestagung der Deutschen Diabetes-Gesellschaft | 12.–15. Mai 2010, Stuttgart
tet, dass Mimitin sich aus den Mitochondrien in das Zytoplasma bewegte
und dort mit MAP1S interagiert. Mimitin-Überexpression schützte die
INS 1E Zellen deutlich gegenüber Zytokintoxizität (MTT Assay nach
24 Stunden: INS 1E pcDNA3 IL-1b 51 € 6, Zytokinmix 37 € 5 vs.
INS 1E-hMim IL-1b 96 € 1, Zytokinmix 79 € 3%). Auch die Proliferationrate
war bei INS 1E-hMim Zellen nach einer 24 h Inkubation mit Zytokinen
deutlich höher als bei Kontrollzellen (INS 1E pcDNA3 IL-1b 58%, Zytokinmix
28% vs. INS 1E-hMimitin IL-1b 85%, Zytokinmix 53%). Die durch
Zytokine induzierte Caspase-3 Aktivierung wurde vollständig in
INS 1E-hMim Zellen aufgehoben (24 h, INS 1E: IL-1b 175 € 24, Zytokinmix
210 € 52; INS1E-hMim: IL-1b 112 € 13, Zytokinmix 88 € 10%). Die Aktivierung
von mitochondrialer Caspase-9 wurde durch Mimitin Überexpression
auch beeinflusst (24 h, INS1E: IL-1b 177 € 13, Zytokinmix
172 € 19; INS1E-hMim: IL-1b 122 € 7, Zytokinmix 150 € 12%). Interessanterweise
wurden Caspase-8, die den extrinsischen apoptotischen Pathway
auslöst, und auch Caspase-12, die mit ER Stress in Verbindung
gebracht wird, gehemmt (Caspase-8 nach 24 h, INS 1E: IL-1b 234 € 11,
Zytokinmix 168 € 6; INS 1E-hMim IL-1b 111 € 13, Zytokinmix 143 € 12%;
Caspase-12, INS1E: IL-1b 140 € 19, Zytokinmix 191 € 26; INS1E-hMim:
IL-1b 101 € 10, Zytokinmix 116 € 15%). Es wurden keine signifikanten
Effekte der Mimitin Überexpression auf den NFkB-iNOS Pathway beobachtet.
Schlussfolgerungen: Somit schützt Mimitin insulinproduzierende
Zellen gegenüber Zytokintoxizität durch Unterdrückung der MAP1S
Wirkung.
P268
Die Bedeutung des peroxisomalen
Fettsäurestoffwechsels für die Lipotoxizität in
insulinproduzierenden Zellen
Gehrmann W 1 , Würdemann W 1 , Elsner M 1 , Lenzen S 1
1
Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische
Biochemie, Hannover, Germany
Fragestellung: Erhöhte Konzentrationen langkettiger gesättigter Fettsäuren
können beim T2DM zu einer b-Zell-Dysfunktion und -Apoptose
führen, wohingegen ungesättigte Fettsäuren einen protektiven Effekt
haben. Langkettige Fettsäuren können sowohl in den Mitochondrien
als auch in den Peroxisomen metabolisiert werden. Während in den
Mitochondrien ATP gebildet wird, entsteht als Produkt der b-Oxidation
in den Peroxisomen H2O2. Dab-Zellen nur über eine geringe Expression
an Katalase verfügen, sind sie besonders empfindlich gegenüber der
vermehrten Bildung an H2O2. Daher war es Ziel dieser Studie, die Bildung
von H2O2 in den Peroxisomen zu untersuchen, sowie den kettenlängenabhängigen
protektiven Effekt von ungesättigten Fettsäuren und
die Aktivierung verschiedener kompartimentspezifischer Initiator-Caspasen
zu analysieren. Methodik: Die Zellvitalität von insulinproduzierenden
RINm5F-Zellen wurde nach 24-stündiger Inkubation mit verschiedenen
Fettsäuren im MTT-Assay bestimmt. Die Aktivierung von
Caspase-8, -9 und -12 wurde nach 12, 18 und 24-stündiger Inkubation
mit 100 mM Palmitinsäure in einem FACS-basierten Assay ermittelt. Das
Fluoreszenzprotein HyPer, das eine intrazelluläre H2O2-Konzentrations-
Messung ermöglicht, wurde spezifisch in den Peroxisomen von Katalase
überexprimierenden RINm5F-Zellen überexprimiert. Die ¾nderungen
der H2O2-Konzentration nach Palmitinsäureinkubation wurden mit einem
Mikrotiterplatten-Fluorometer detektiert. Ergebnisse: Der protektive
Effekt von einfach ungesättigten Fettsäuren gegenüber Palmitinsäure-induzierter
Toxizität war abhängig von deren Kettenlänge. Während
Ölsäure (C18:1) und Palmitoleinsäure (C 16:1) einen ausgeprägten protektiven
Effekt aufwiesen, vermittelten Myristoleinsäure (C 14:1) und
Dodecensäure (C 12:1) keinen deutlichen Schutz mehr. Die Todesrezeptor-spezifische
Caspase-8, sowie die mitochondriale Caspase-9 und die
ER-spezifische Caspase-12 waren nach 18-stündiger Palmitinsäureinkubation
signifikant um 10 – 15% im Vergleich zur Kontrolle aktiviert mit
einer verstärkten Aktivierung nach 24 h. Zwischen der Aktivierung der
unterschiedlichen Caspasen gab es zu keinem Zeitpunkt signifikante
Unterschiede. Die H2O2-Konzentration, die mithilfe des HyPer-Proteins
gemessen werden konnte, war infolge einer 24-stündigen Palmitinsäureinkubation
signifikant erhöht. Durch eine zusätzliche Überepression
von Katalase in Peroxisomen konnte dieser Anstieg signifikant reduziert
werden, wohingegen eine Überexpression von Katalase in den Mitrochondrien
keinen protektiven Effekt hatte. Schlussfolgerungen: Das
die analysierten Initiator-Caspasen gleichermaßen durch Palmitinsäure
aktiviert wurden, deutet auf einen gemeinsamen aktivierenden Faktor
hin. Durch das HyPer-Protein konnte gezeigt werden, dass es sich dabei
vermutlich um peroxisomal gebildetes H2O2 handelt. Auch der kettenlängenabhängige
protektive Effekt ungesättigter Fettsäuren deutet auf
eine Beteiligung des peroxisomalen Fettsäure-Metabolismus bei der Lipotoxizität
hin.
Postersitzung 28: Insulinsekretion, Insulinwirkung
P269
Akute und Chronische Effekte von
Wnt-Stimulation auf pankreatische beta-Zellen –
Regulation durch Exendin-4
Heller C 1 , Kühn MC 1 , Ülgen F 1 , Scherbaum WA 1 , Schinner S 1
1 Uniklinik Düsseldorf, Endokrinologie, Düsseldorf, Germany
Fragestellung: Akute Wnt-Stimulation induziert eine Proliferation von
beta-Zellen. Die Wirkung chronischer Wnt-Stimulation ist in beta-Zellen
nicht untersucht. Klotho, ein Regulator zellulären Alterns, ist als extrazellulärer
Wnt-Antagonist identifiziert worden. Die Regulation der Expression
von Wnt-Signalmolekülen und von Klotho durch metabolische
und pharmakologische Stimuli in beta-Zellen ist nicht bekannt. Deshalb
haben wir die Wirkung chronischer Wnt-Stimulation, die Bedeutung
von Klotho und deren Regulation in pankreatischen beta-Zellen untersucht.
Methodik: Transiente Transfektionen mit in Ins-1 beta-Zellen.
Isolierung, Kultivierung, mRNA und Protein Extraktion primärer muriner
Inselzellen. Expressionsanalyse auf mRNA Ebene (PCR) und Proteinebene
(Western Blot). Proliferationsassays (3 H-thymidine uptake). Immunhistochemie
von Pankreata von wildtyp und NZO (New-Zealand Obese)
Mäusen. Ergebnisse: Klotho und Wnt4 Expression wurden in primären
murinen beta-Zellen detektiert (mRNA und Protein). Die Expression von
Wnt-Signalmolekülen wurde in vitro nicht durch Glucose (5,5mM,
11mM, 16,7mM), Insulin (10 mM), Tolbutamid (100 mM), Rosiglitazone
(100nM) oder Metformin (500 mM) in insulin-produzierenden Zellen reguliert.
Das GLP-1 Analogon Exendin-4 (10nM) führte aber zu einem
zweifachen (p < 0,001) Anstieg der Wnt4 mRNA Expression. Wnt4 wurde
in einem adipösen Mausmodell (NZO) in pankreatischen Inseln verstärkt
exprimiert, während die Expression von Klotho in NZO im Vergleich
zu Kontrolltieren vermindert war. Funktionell fanden wir, dass
Klotho die Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs durch Wnt3a
in beta-Zellen antagonisiert. Im Gegensatz zur akuten Wnt-Stimulation
hemmte eine chronische (7 d) Behandlung mit Wnt3a die Proliferation
primärer beta-Zellen um 46% (p < 0,05). Ebenso wurde die Proliferation
von Ins-1 Zellen unter chronischer Wnt-Stimulation (nach 35 d) deutlich
auf 18% der unbehandelten Kontrolle gehemmt (p < 0,05). Diese Hemmung
konnte durch Co-Stimulation mit Klotho wieder aufgehoben werden
und es wurde eine Re-Induktion der Proliferation auf 136%
(p < 0,05) erreicht. Schlussfolgerung: Diese Daten zeigen die Expression
von endogenen Wnts und Klotho in pankreatischen beta-Zellen. Die
Expression von Wnt4 und Klotho sind in einem adipösen Mausmodell
(NZO) gegenläufig reguliert. Klotho hebt die Hemmung der Proliferation
unter chronischer Wnt-Stimulation wieder auf, was der Wnt-Klotho Interaktion
eine Bedeutung bei der Regulation der beta-Zell Proliferation
zuweist. Wnt4 wird nach exendin-4 verstärkt exprimiert, was eine weitere
Interaktion des Wnt-Signalwegs mit dem Inkretinsystem in beta-
Zellen darstellt.
P270
Diabetologie & Stoffwechsel 2010; 5: S1–S106 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York · ISSN 1861-9002
Das Protein p8 wird akut und temporär in STZ
geschädigten Betazellen hochreguliert und
verhindert Apoptose durch Inhibition der
Caspasen 3 und 7
Pilz IH 1 , Päth G 1 , Tsaroucha E 1 , Dufner B 1 , van Loosen S 1 ,
Alt M 1 , Hopt UT 2 , Seufert J 1
1 Innere Medizin II/Universitätsklinikum Freiburg,
Endokrinologie Diabetologie, Freiburg, Germany,
2 Chirurgische Klinik/Universitätsklinikum Freiburg,
Allgemein und Viszeralchirurgie, Freiburg, Germany
Fragestellung: Im exokrinen Pankreas induziert eine Pankreatitis die
Expression des Protein p8 und schützt damit exokrines Gewebe vor
Entzündungsschäden. Eigene Vorarbeiten bestimmten p8 als einen glucoseabhängigen
Mediator endokriner pankreatischer Betazellproliferation.
Anfängliche Daten zeigten einen reduzierten Streptozotozin (STZ)
induzierten diabetogenen Schaden in transient p8 überexprimierenden
INS-1 Betazellen. Dies äußerte sich in einer durch Annexin V FACS Analyse
ermittelten reduzierten Apoptoserate. Resultate: Inzwischen analysierten
wir die Rolle stabiler p8 Expression in vitro. Stabile p8- INS-1E
Zellen weisen erhöhte basale Viabilität und signifikant erhöhte Zellzahlen
nach 5-tägiger Kultur gegenüber Zellen mit Vektorkontrollen (Mock)
auf. Bei 0 – 1 mM STZ Schädigung (LD 50 = 0,66 mM) reduziert p8 Überxpression
signifikant die Aktivierung der Apoptoseeffektoren Caspase
3 und 7 um 50 – 65% nach 8 h. Nach 24 h ist die Caspase 3/7 Aktivierung
noch um 25 – 29% reduziert, womit dies auf einen Schutz durch p8
während akuter Gewebeschädigung hinweist. Dies korreliert mit unserer
Beobachtung, dass die p8 mRNA Expression dosisabhängig durch STZ