International Congress BIOLOGICAL PRODUCTS - Gruppo di ...

Durante l’esperimento, per due volte la settimana, è stato eseguito il conteggio delle femmine di Varroa cadute sul
fondo dell’arnia. Alla fine della prova sono stati nuovamente eseguiti i rilievi, per valutare consistenza e livello di
infestazione degli alveari trattati e testimone.
Prima, durante e dopo il trattamento, sono stati inoltre eseguiti i prelievi di miele e di cera da ciascun alveare trattato e
testimone, nonché dei formulati dai soli alveari trattati, per valutare la persistenza e i residui del timolo.
I campioni di miele (~ 5 g per campione) sono stati prelevati da 100 cellette disopercolate scelte a caso da tre favi del
nido di ciascun alveare, aspirandolo con una siringa. Il campione di cera (~ 10 g) è stato ottenuto tagliando 3 porzioni di
circa 2 cm 2 prelevati da diversi favi del nido di ciascun alveare. Infine, i prelievi delle formulazioni sono stati effettuati
asportando un frammento di gelatina o di vermiculite. I campioni sono stati conservati in freezer (-18°C) fino al
momento dell’analisi.
L’efficacia dei trattamenti è stata valutata impiegando come parametro la percentuale di mortalità M (Henderson e
Tilton, 1955) calcolata come:
⎡ ⎛ Bc ⋅ At ⎞⎤
M = 100 ⋅ ⎢1
− ⎜ ⎟⎥
⎣ ⎝ Bt ⋅ Ac ⎠⎦
dove Bc e Bt rappresentano la percentuale di infestazione (degli adulti o della covata opercolata) prima del trattamento,
rispettivamente negli alveari testimone (Bc) e in quelli trattati (Bt); Ac e At rappresentano la percentuale di infestazione
dopo il trattamento, rispettivamente negli alveari testimone e in quelli trattati.
Reattivi
Gli standard analitici del Timolo (98%), Cineolo (99%), Mentolo (96%) e Canfora (96%) sono stati ottenuti dalla
Aldrich Chemical, Janssen (Geel, Belgium), Carlo Erba (Milano Italia), rispettivamente. Le soluzioni madre (1000
mg/Kg) sono state preparate in acetone (SupraSolv, Merck, Darmstadt, Germany). Le soluzioni di lavoro sono state
preparate giornalmente, per diluizione con estratti in dietil etere di miele e cera non trattati (controlli). Il dietil etere era
solvente per analisi (Merck, Darmstadt, Germany).
Procedure di estrazione
Formulati - Un g di ciascun formulato è stato pesato in un provettone da 50 ml con tappo a vite, venivano poi aggiunti
20 ml of metanolo (Chromanorm per HPLC, Prolabo) ed il protettone agitato (15 min) in un agitatore rotante e poi
sonificato per 5 min in un bagno ad ultrasuoni (Transsonic T460). Un’aliquota di metanolo (100 µl) veniva diluita a 5
ml con acetone ed iniettata in GC.
Miele - Un g di miele veniva pesato in un provettone da 15 ml con tappo a vite e veniva solubilizzato con 2 g d’acqua,
venivano poi aggiunti 2 ml di etere dietilico, ed il protettone agitato (10 min) in un agitatore rotante. Dopo separazione
delle fasi, un’aliquota dell’estratto era iniettata in GC.
Cera - Si pesavano 0,5 g di cera in un provettone da 25 ml con tappo a vite, si aggiungevano 5 ml di miscela
metanolo/acqua (1:1) ed il provettone veniva immerso in un bagnomaria a 70 °C fino a dissoluzione della cera, e quindi
agitato in vortex per 1 min. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, venivano aggiunti 5 ml di etere dietilico, ed il
provettone sottoposto ad agitazione per 15 min. in agitatore rotante. Dopo sepa-razione delle fasi, l’estratto etereo
veniva centrifugato ed un’aliquota iniettata in GC.
Recuperi
Campioni non trattati di miele e cera venivano fortificati con 0,1, 0,5, 2,0 e 5,0 mg/Kg of timolo, mentolo, cineolo e
canfora, ed analizzati secondo le metodiche descritte precedentemente. Le analisi sono state replicate quattro volte per
ogni livello di fortificazione. La media dei recuperi ottenuti per il miele era 97% (range 84-111%) con un coefficiente di
variazione massimo (CV) del 5,6%; e per la cera 89% (range 82-98%) con un coefficiente di variazione massimo (CV)
di 8,5%.
Gascromatografo
I campioni sono stati analizzati usando un gascromatografo HRGC 5160 Serie Mega equipaggiato con un detector FID
80 , un’autocampionatore AS 800, un’iniettore split-splitless (Carlo Erba, Milano, Italia), e collegato ad un integratore
HP 3396 A (Hewlett Packard, Avondale, PA, USA). La colonna era una capillare in silice fusa DB-5 MS (5% Phenyl-
Methyl-Polysiloxane) 30 m x 0.25 mm id e 0.1µm di spessore del film (J&W Scientific, Folsom, CA). L’iniettore ed il
detector erano tenuti ad una temperatura di 100 °C e 200 °C, rispettivamente. Le analisi dei formulati venivano eseguite
iniettando 2 µl in modalità split, con rapporto di splitaggio di 1:10, mentre tutti gli altri campioni venivano analizzati
iniettando 2 µl in modalità splitless (30 s). La temperatura del forno era programmata come segue: 60 °C (5 min), salita
fino a 130 °C (2 °C/min) ed isoterma per 4 min, salita fino a 180 °C (10 °C/min). L’elio era il gas di trasporto e di
makeup a 1,8 e 30 ml/min, rispettivamente. La fiamma del FID era alimentata da aria ed idrogeno a 250 e 30 ml/min,
rispettivamente. Le rette di taratura venivano calcolate fra le altezze dei picchi e le concentrazioni utilizzando il metodo
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