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Durante l’esperimento, per due volte la settimana, è stato eseguito il conteggio delle femmine di Varroa cadute sul fondo dell’arnia. Alla fine della prova sono stati nuovamente eseguiti i rilievi, per valutare consistenza e livello di infestazione degli alveari trattati e testimone. Prima, durante e dopo il trattamento, sono stati inoltre eseguiti i prelievi di miele e di cera da ciascun alveare trattato e testimone, nonché dei formulati dai soli alveari trattati, per valutare la persistenza e i residui del timolo. I campioni di miele (~ 5 g per campione) sono stati prelevati da 100 cellette disopercolate scelte a caso da tre favi del nido di ciascun alveare, aspirandolo con una siringa. Il campione di cera (~ 10 g) è stato ottenuto tagliando 3 porzioni di circa 2 cm 2 prelevati da diversi favi del nido di ciascun alveare. Infine, i prelievi delle formulazioni sono stati effettuati asportando un frammento di gelatina o di vermiculite. I campioni sono stati conservati in freezer (-18°C) fino al momento dell’analisi. L’efficacia dei trattamenti è stata valutata impiegando come parametro la percentuale di mortalità M (Henderson e Tilton, 1955) calcolata come: ⎡ ⎛ Bc ⋅ At ⎞⎤ M = 100 ⋅ ⎢1 − ⎜ ⎟⎥ ⎣ ⎝ Bt ⋅ Ac ⎠⎦ dove Bc e Bt rappresentano la percentuale di infestazione (degli adulti o della covata opercolata) prima del trattamento, rispettivamente negli alveari testimone (Bc) e in quelli trattati (Bt); Ac e At rappresentano la percentuale di infestazione dopo il trattamento, rispettivamente negli alveari testimone e in quelli trattati. Reattivi Gli standard analitici del Timolo (98%), Cineolo (99%), Mentolo (96%) e Canfora (96%) sono stati ottenuti dalla Aldrich Chemical, Janssen (Geel, Belgium), Carlo Erba (Milano Italia), rispettivamente. Le soluzioni madre (1000 mg/Kg) sono state preparate in acetone (SupraSolv, Merck, Darmstadt, Germany). Le soluzioni di lavoro sono state preparate giornalmente, per diluizione con estratti in dietil etere di miele e cera non trattati (controlli). Il dietil etere era solvente per analisi (Merck, Darmstadt, Germany). Procedure di estrazione Formulati - Un g di ciascun formulato è stato pesato in un provettone da 50 ml con tappo a vite, venivano poi aggiunti 20 ml of metanolo (Chromanorm per HPLC, Prolabo) ed il protettone agitato (15 min) in un agitatore rotante e poi sonificato per 5 min in un bagno ad ultrasuoni (Transsonic T460). Un’aliquota di metanolo (100 µl) veniva diluita a 5 ml con acetone ed iniettata in GC. Miele - Un g di miele veniva pesato in un provettone da 15 ml con tappo a vite e veniva solubilizzato con 2 g d’acqua, venivano poi aggiunti 2 ml di etere dietilico, ed il protettone agitato (10 min) in un agitatore rotante. Dopo separazione delle fasi, un’aliquota dell’estratto era iniettata in GC. Cera - Si pesavano 0,5 g di cera in un provettone da 25 ml con tappo a vite, si aggiungevano 5 ml di miscela metanolo/acqua (1:1) ed il provettone veniva immerso in un bagnomaria a 70 °C fino a dissoluzione della cera, e quindi agitato in vortex per 1 min. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, venivano aggiunti 5 ml di etere dietilico, ed il provettone sottoposto ad agitazione per 15 min. in agitatore rotante. Dopo sepa-razione delle fasi, l’estratto etereo veniva centrifugato ed un’aliquota iniettata in GC. Recuperi Campioni non trattati di miele e cera venivano fortificati con 0,1, 0,5, 2,0 e 5,0 mg/Kg of timolo, mentolo, cineolo e canfora, ed analizzati secondo le metodiche descritte precedentemente. Le analisi sono state replicate quattro volte per ogni livello di fortificazione. La media dei recuperi ottenuti per il miele era 97% (range 84-111%) con un coefficiente di variazione massimo (CV) del 5,6%; e per la cera 89% (range 82-98%) con un coefficiente di variazione massimo (CV) di 8,5%. Gascromatografo I campioni sono stati analizzati usando un gascromatografo HRGC 5160 Serie Mega equipaggiato con un detector FID 80 , un’autocampionatore AS 800, un’iniettore split-splitless (Carlo Erba, Milano, Italia), e collegato ad un integratore HP 3396 A (Hewlett Packard, Avondale, PA, USA). La colonna era una capillare in silice fusa DB-5 MS (5% Phenyl- Methyl-Polysiloxane) 30 m x 0.25 mm id e 0.1µm di spessore del film (J&W Scientific, Folsom, CA). L’iniettore ed il detector erano tenuti ad una temperatura di 100 °C e 200 °C, rispettivamente. Le analisi dei formulati venivano eseguite iniettando 2 µl in modalità split, con rapporto di splitaggio di 1:10, mentre tutti gli altri campioni venivano analizzati iniettando 2 µl in modalità splitless (30 s). La temperatura del forno era programmata come segue: 60 °C (5 min), salita fino a 130 °C (2 °C/min) ed isoterma per 4 min, salita fino a 180 °C (10 °C/min). L’elio era il gas di trasporto e di makeup a 1,8 e 30 ml/min, rispettivamente. La fiamma del FID era alimentata da aria ed idrogeno a 250 e 30 ml/min, rispettivamente. Le rette di taratura venivano calcolate fra le altezze dei picchi e le concentrazioni utilizzando il metodo PDF creato con FinePrint pdfFactory versione dimostrativa http://www.secom.re.it/fineprint 80
dello standard esterno. E’ stata trovata una buona linearità nel range 0,1-5,0 mg/Kg con un coefficiente di correlazione di 0,9994. Il cleanup non era necessario in quanto non vi erano picchi interferenti. Il limite di determinazione (Their and Zeumer, 1987) era di 0,1 mg/Kg. Analisi Statistica I dati acquisiti durante la sperimentazione sono stati sottoposti ad analisi statistica (ANOVA) previa trasformazione angolare (arcsin √y/100), nel caso di valori percentuali, al fine di ridurre l’eterogeneità della varianza. Nelle tabelle e nelle figure sono riportati I valori non trasformati. Quando I test F risultavano significativi, le medie sono state separate applicando il test della Differenza Minima Significativa (LSD con α = 0,05). RISULTATI E DISCUSSIONE Efficacia dei trattamenti La tabella I evidenzia come, prima dell’ inizio degli esperimenti, nessuna differenza statisticamente significativa fosse riscontrabile fra i tre gruppi sperimentali, relativamente alla superficie di covata opercolata ed ai livelli di infestazione. La tabella II riporta i valori per gli stessi parametri registrati al termine del trattamento. Tab. I – Infestazione e consistenza degli alveari prima del trattamento. Gruppo di Alveari Infestazione covata Infestazione api adulte Superficie di covata opercolata (%) (%) (cm 2 ) Api Life Var® 2,6 ± 1,2 3,1 ± 1,7 2.387 ± 1.071 Apiguard 2,6 ± 1,0 2,8 ± 1,0 2.425 ± 1.128 Testimone 2,8 ± 2,2 2,1 ± 0,9 2.368 ± 977 Le medie nella stessa colonna non sono significativamente differenti (ANOVA, P > 0,05) Tab. II – Infestazione e consistenza degli alveari dopo il trattamento. Gruppo di Alveari Infestazione covata Infestazione api adulte Superficie di covata opercolata (%) (%) (cm 2 ) Api Life Var® 0,7 ± 0,5 a 0,4 ± 0,5 a 902 ± 319 a Apiguard 1,7 ± 0,6 a 1,5 ± 1,0 a 1.090 ± 263 a Testimone 8,4 ± 4,8 b 8,0 ± 6,1 b 1.598 ± 282 b Le medie nella stessa colonna seguite dalla stessa lettera non sono significativamente differenti (ANOVA, P > 0,05 LSD test) I livelli di infestazione, sia della covata sia degli adulti, sono diminuiti nei trattati ed aumentati nel testimone, mentre la superficie di covata opercolata è diminuita in tutti e tre i gruppi anche se in misura maggiore nei trattati. Le differenze riscontrate sono risultate statisticamente significative solo tra i trattati ed il testimone. Tali differenze, evidenziano un effetto del timolo sulla consistenza delle colonie, con una flessione più marcata negli alveari trattati rispetto ai testimoni. L’efficacia, espressa in termini di percentuale di mortalità, nel gruppo trattato con Apiguard, è risultata pari a 90,4 ± 8,3% ed a 95,5 ± 8,7%, considerando, rispettivamente, il livello di infestazione della covata e degli adulti. Nel gruppo trattato con Api Life VAR®, considerando i medesimi parametri nello stesso ordine, sono stati riscontrati valori pari a 74,8 ± 13,1% e di 81,3 ± 15,5%. Tali differenze non sono risultate statisticamente significative per effetto dell’elevata variabilità rilevata all’interno di ogni gruppo, che evidenzia un’azione di tale composto volatile presumibilmente condizionata da fattori biologici e microclimatici interni all’alveare. L’andamento della caduta degli acari durante l’esperimento, è riportato nella Figura 1. La mortalità più elevata é stata riscontrata nel gruppo trattato con Apiguard durante la prima settimana di trattamento e, in seguito alla sostituzione delle vaschette, nella terza settimana. PDF creato con FinePrint pdfFactory versione dimostrativa http://www.secom.re.it/fineprint 81
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