Neue Wege in der Diagnostik und Therapie bei dystrophischen

Patienten und Methoden 33
sequenzierten wir das Exon 4 und das Exon 12 des BIGH3-Gens, in dem bereits hot-spots
für diese Untergruppen beschrieben worden waren.
Bei der Familie D1 und den Einzelpersonen D2, D3 und D4 mit der klinischen Diagnose einer
Hornhautdystrophie vom Typ Thiel-Behnke und bei der Familie E1 und dem Patienten E2 mit
einem nicht zuordenbaren Hornhautbefund sequenzierten wir alle 17 Exons des BIGH3-
Gens.
Bei der Familie F1 und den Patienten F2 bis F4 mit der klinischen Diagnose einer makulären
Hornhautdystrophie sequenzierten wir alle 4 Teilabschnitte des Exon 3 des CHST6-Gens.
Die gewonnenen Sequenzen verglichen wir mit der für das BIGH3-Gen publizierten
Gensequenz (GenBank accession number M77349) und mit der für das CHST6-Gen
publizierten Gensequenz (GenBank accession number AF2199990). Wurden Mutationen
entdeckt, führten wir die erneute PCR-Reaktion des entsprechenden Exons und eine direkte
Sequenzierung des reverse-Strangs durch.
- Indirekter Mutationsnachweis mit Restriktionsenzymen
Handelte es sich um bisher noch nicht beschriebene Mutationen, bestätigten wir die
Ergebnisse nach erneuter PCR durch den Restriktionsverdau (Restriktionsfragmentlängen-
Polymorphismus; PCR-RFLP) mit einem Restriktionsenzym. Wir amplifizierten mit Hilfe der
PCR die DNA des betroffenen Exons aller erkrankten sowie von gesunden
Familienmitgliedern und von nichtverwandten gesunden Probanden mit Hilfe des für dieses
Exon oben beschriebenen Primerpaars unter denselben Bedingungen. Die Produkte wurden
auf einem 7%igen Polyacrylamidgel aufgetragen.
Die in Frage kommenden Restriktionsenzyme wählten wir mit Hilfe der Datenbank NEBcutter
V2.0 (tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) aus. Um eventuelle Polymorphismen
auszuschließen, wurde der Restriktionsverdau ebenfalls bei 100 gesunden, nichtverwandten
Probanden durchgeführt.
2. 1. 4 Therapeutisches Vorgehen
- BIGH3-gekoppelte Hornhautdystrophien
Wir behandelten insgesamt 16 Augen von 9 Patienten mit einer PTK. Dabei wurde die PTK
in 2 Fällen bei einem Rezidiv nach Hornhauttransplantation durchgeführt. Wir
diagnostizierten bei diesen Patienten in einem Fall (ein Auge) den Aminosäurenaustausch
Arg124Cys (=gittrige Hornhautdystrophie Typ I, Biber-Haab-Dimmer) in 5 Fällen (9 Augen)
den Aminosäurenaustausch Arg555Trp (=granuläre Hornhautdystrophie Typ I, Groenouw)
und in 2 Fällen (4 Augen) den Aminosäurenaustausch Arg124His (granuläre