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4 Diskussion Es wird angenommen, dass der Translokonkanal während der cotranslationalen Translo- kation impermeabel für Ionen ist (Simon und Blobel, 1991; Crowley et al., 1994; Ham- man et al., 1997; Roy und Wonderlin, 2003; Wirth et al., 2003). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Aktivierung des Sec61-Kanals durch Ribosomen-Depletion gezeigt werden (3.1.1). Wird die naszierende Polypeptidkette durch Behandlung mit Puromycin oder Pactamycin entfernt, so ist für den Ribosom-Translokon-Komplex eine Permeation kleiner Moleküle und Ionen zu be- obachten (Simon und Blobel, 1991; Heritage und Wonderlin, 2001; Lomax et al., 2002; Roy und Wonderlin, 2003; Van Coppenolle et al., 2004; Flourakis et al., 2006; Lizak et al., 2006; Giunti et al., 2007; Ong et al., 2007; Amer et al., 2009). Mehrere Studien legen nahe, dass Ribosomen auch nach nativer Beendigung der Translokation teilweise in einer stabilen Assoziation mit dem Translokon verbleiben (Borgese et al., 1973; Seiser und Nicchitta, 2000; Potter und Nicchitta, 2002; Schaletzky und Rapoport, 2006). Neben der vorliegenden Arbeit haben weitere elektrophysiologische Untersuchungen ebenfalls hohe Ionenleitfähigkeiten für den Ribosomen-depletierten Sec61-Komplex gezeigt (Wirth et al., 2003; Wonderlin, 2009). Verschiedene Autoren haben vorgeschlagen, dass das ER- luminale Chaperon BiP die wassergefüllte Pore des Sec61-Kanals verschließt (Hamman et al., 1998; Haigh und Johnson, 2002; Wirth et al., 2003; Alder et al., 2005), während Untersuchungen am intakten ER und damit in Anwesenheit von BiP eine Permeation kleiner Moleküle und Ca 2+ -Ionen durch den Sec61-Kanal gezeigt haben (Heritage und Wonderlin, 2001; Lomax et al., 2002; Roy und Wonderlin, 2003; Van Coppenolle et al., 2004; Flourakis et al., 2006; Ong et al., 2007). Ein stimmiges Bild der Regulation des Translokon-vermittelten basalen Calcium-Leckstromes aus dem ER ergibt sich somit bisher nicht. Unter Einbeziehung der beobachteten Regulation des Sec61-Komplexes durch Calmodu- lin stellt sich die Frage, warum in den Experimenten am intakten ER ein Translokon- vermittelter Ca 2+ -Ausstrom beobachtet werden konnte. Bei Lomax et al. (2002) wurden die verwendeten Pankreas-Zellen aus Mus musculus perfundiert und die Konzentration an cytosolischem Ca 2+ mit 10 mM BAPTA auf 90 nM eingestellt, bei Van Coppenolle et al. (2004) und Flourakis et al. (2006) wurden LNCaP-Zellen mit Digitonin permea- bilisiert, kontinuierlich perfundiert und die Konzentration an cytosolischem Ca 2+ mit EGTA auf 170 nM eingestellt. Es liegt nahe, dass durch die Perfusion der Zellen ein Großteil des cytosolischen Calmodulins entfernt wurde. Freies Ca 2+ wurde zudem nicht nur durch BAPTA oder EGTA, sondern auch durch die verwendeten Ca 2+ -sensitiven Farbstoffe chelatiert. Es ist davon auszugehen, dass die Konzentrationen an cytosolischem Ca 2+ deutlich unter den Affinitäten der N- und C-terminalen Domäne von CaM für Ca 2+ -Ionen lagen (KD ≈2 µM bzw. 0,2 µM, Potter et al., 1983; Ogawa und Tanoku- 94
4.8 Regulation des Sec61-Komplexes durch Calmodulin ra, 1984). Somit wurden die Bedingungen in den genannten Experimenten so gewählt, dass das cytosolische Calmodulin als Calcium-freies ApoCalmodulin vorlag. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit war die CaM-Regulation des Sec61-Kanals damit nicht wirksam. Physiologische Bedeutung der Regulation des Sec61-Komplexes durch CaM Die kontrollierte Freisetzung von Ca 2+ -Ionen aus dem ER in das Cytosol der Zelle regu- liert eine Vielzahl physiologischer und biochemischer Prozesse wie Muskelkontraktion, Exocytose und Apoptose (Berridge et al., 2000). Der Kontrollmechanismus für diesen Vorgang wird als Ca 2+ -induced Ca 2+ -release (CICR) bezeichnet. Dabei werden Inositol- 1,4,5-Trisphosphat- und Ryanodin-Rezeptoren (IP3-R/RyR) in der ER-Membran durch Calcium aktiviert. Beide Kanäle vermitteln daraufhin eine zusätzliche Freisetzung von Ca 2+ aus dem ER. Die so entstehenden lokal erhöhten Ca 2+ -Konzentrationen (Calcium- Puffs oder -Sparks) an der ER-Membran können örtlich abgegrenzt biochemische Vor- gänge regulieren sowie weitere IP3-R und RyR aktivieren und damit zellweite Ca 2+ - Signale auslösen (Berridge et al., 2003; Berridge, 2006). Ein unkontrollierter Calcium- Leckstrom durch den weiten Sec61-Kanal würde die zeitlich und räumlich strikt koordi- nierte Konzentration freier Ca 2+ -Ionen auf der cytosolischen Seite der ER-Membran in erheblichem Maße stören. Elektrophysiologische Untersuchungen haben ergeben, dass Ca 2+ -Konzentrationen ≤1 µM für die Aktivierung des IP3-R (Boehning et al., 2001; Fos- kett et al., 2007) sowie von 1-10 µM für die Aktivierung des RyR (Xu et al., 1996) aus- reichend sind. Es wird davon ausgegangen, dass der von einem einzelnen IP3-Rezeptor vermittelte Ca 2+ -Strom weitere IP3-R oder RyR aktivieren und so einen saltatorischen Mechanismus auslösen kann (Berridge, 2006; Foskett et al., 2007). Es ist anzunehmen, dass ein unkontrollierter Calcium-Leckstrom durch den weiten Sec61-Kanal bei hin- reichender räumlicher Nähe ebenfalls IP3- bzw. Ryanodin-Rezeptoren aktivieren und damit die Calcium-induzierte Calcium-Freisetzung auslösen könnte. Über der Membran des ER besteht im Ruhezustand der Zelle ein Calcium-Gradient von 3-4 Größenordnungen (Yu und Hinkle, 2000; Smith et al., 2001; Alvarez und Monte- ro, 2002). Calcium-Leckströme werden über einen aktiven Uptake-Mechanismus durch SERCA-ATPasen kompensiert. Dabei wird für zwei transportierte Ca 2+ -Ionen ein ATP hydrolysiert (Wuytack et al., 2002). Es ist somit nicht nur für die Kontrolle der Calcium- Homeostase an der ER-Membran, sondern auch für die Effizienz des cytosolischen Ener- giemetabolismus unabdingbar, einen Ca 2+ -Leckstrom durch den Sec61-Kanal zu regulieren. Für verschiedene Ionenkanäle wurde eine Ca 2+ -abhängige, negative Feedback-Regulati- on über Calmodulin gezeigt, die allgemein als calcium-dependent inactivation (CDI) be- 95
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Zur Regulation der Proteintransloka
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Inhaltsverzeichnis 2.2.7 Fluoreszen
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1 Einleitung Eine der wichtigsten F
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1.2 Die Protein-Translokase des End
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1.3 Das Endoplasmatische Retikulum
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1.4 Calmodulin konnten zeigen, dass
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1.4 Calmodulin mit der N-terminalen
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wie Lanthan? 1.5 Zielsetzung der vo
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2.1 Verwendete Proben Abbildung 2.1
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2.1 Verwendete Proben pIVEX2.3MCS),
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2.2 Biochemische Methoden wurden di
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2.2 Biochemische Methoden Peptid in
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2.3 Elektrophysiologische und bioph
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2.3.5 Liquid junction Potenziale 2.
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ω1 = � 4DτD π ω1 = Fokusradiu
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3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung
Seite 49 und 50: 3.1 Charakterisierung des Sec61-Kom
Seite 77 und 78: 3.2 Charakterisierung der rauen Mik
Seite 83 und 84: 4 Diskussion 4.1 Fusion der Proben
Seite 85 und 86: 4.2 Schaltverhalten und Leitwerte d
Seite 91 und 92: 4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
Seite 93 und 94: 4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
Seite 95 und 96: 4.6 Interaktion mit Lanthan- und Al
Seite 97 und 98: 4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
Seite 99: 4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
Seite 103 und 104: 4.9 Veränderungen durch Ribosomen
Seite 105 und 106: 4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
Seite 107 und 108: • Ribosomen führen in nanomolare
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Seite 129: PPcecA Preprocecropin A PS Phosphat
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