b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

3 Ergebnisse
chung 13).
Für die Bindung von Calmodulin an das Sec61α-IQ-Motiv ergibt sich in Anwesenheit
von Ca 2+ -Ionen eine KD von 130 nM ± 27 nM (Abbildung 3.16 c). Die Anpassung der
Werte ergibt eine maximale Sättigung des IQ488 mit CaM von 88 % ± 4 %. Wird freies
Calcium in der Probenlösung mit Hilfe von 10 mM EGTA chelatiert, so kann erst ab
einer CaM-Konzentration von 11 µM eine Interaktion mit dem IQ488-Peptid beobachtet
werden.
Für die Assoziation von GST-CaM mit dem IQ488-Peptid ergibt sich in Anwesenheit
von Ca 2+ eine KD von 119 nM ± 15 nM aus dem Werteverlauf (Abbildung 3.16 d). Die
maximale Sättigung des IQ488 mit GST-CaM liegt bei 92 % ± 3 %. In Abwesenheit
freier Calciumionen interagiert auch GST-CaM erst in höheren Konzentrationen mit
dem IQ-Motiv.
Zusammenfassend zeigt CaM bzw. GST-CaM eine Calcium-abhängige Bindung mit ho-
her Affinität an das Sec61α-IQ-Motiv. Dieses Ergebnis ist mit den Beobachtungen aus
elektrophysiologischen Experimenten am aufgereinigten Sec61-Komplex konsistent.
3.1.11 Veränderungen durch Ribosomen
Cytosolische Ribosomen mit naszierenden Polypeptidketten werden in vivo zu Beginn
der cotranslationalen Translokation SRP-vermittelt an die Membran des Endoplasma-
tischen Retikulums geführt und binden dort an das Translokon (1.2.2). Es sollte un-
tersucht werden, ob und wie Ribosomen die elektrophysiologischen Eigenschaften des
Sec61-Kanals verändern.
Abbildung 3.17 a zeigt eine typische Stromspur des Sec61-Kanals der PKRM-Probe
in Anwesenheit von 15 nM Ribosomen beidseitig der Membran unter symmetrischen
Elektrolytbedingungen (100 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Mops/Tris pH 7). Das
Schaltverhalten ist durch schnelle Übergänge gekennzeichnet, auftretende Schaltereig-
nisse entsprechen größtenteils Leitwerten von 280-350 pS und können damit dem großen
Leitwert des Kanals zugeordnet werden. Schaltereignisse im Bereich des kleinen Leitwer-
tes sind nach Ribosomenzugabe kaum zu beobachten. Diese Charakteristik im Schaltver-
halten des Sec61-Kanals zeigt sich bereits ab einer Ribosomenkonzentration von 7,5 nM
in den Messkammern. Eine Erhöhung der Effektorkonzentration bis auf 221 nM hat
keine weitere Veränderung zur Folge.
Um die Leitwerte des Kanals zu erfassen, werden unter symmetrischen Bedingungen und
in An- und Abwesenheit von Ribosomen aufgenommene Stromspuren nach 2.3.9 ausge-
wertet und die Ergebnisse in Form von Leitwerthistogrammen dargestellt (Abbildung
3.18).
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