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2 Material und Methoden G(τ) = 1 + � 1 + T ·e −τ τ T 1 − T � f1 N 1 1 + τ τD1 1 � 1 + τ τD1κ 2 T = Triplettfraktion τT = Triplettzeit + 1 − f1 N f1 = Fraktion Komponente 1 N = Anzahl der Partikel im Fokus τ = Korrelationszeit τD1 = Diffusionszeit Komponente 1 τD2 = Diffusionszeit Komponente 2 κ = Strukturparameter 1 1 + τ τD2 1 � 1 + τ τD2κ 2 Dabei wurden die zuvor bestimmten Diffusionszeiten des freien IQ488-Peptides als τD1 und des gesättigten IQ488-CaM-Komplexes bzw. des gesättigten IQ488-GST-CaM-Kom- plexes als τD2 festgesetzt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit den Programmen FCS4 (Alf Honigmann, Universität Osnabrück), Excel 2003 und Origin 7.0. Um die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion des IQ488-Peptides mit CaM bzw, GST-CaM zu erhalten wurde der prozentuale Anteil an gebundenem IQ488-Peptid gegen die CaM- bzw. GST-CaM-Konzentration aufgetragen mit einem Ein-Bindungsstellen- Modell angepasst: [CaM] IQ488 − CaM = IQ488 − CaMMax [CaM] + KD IQ488-CaM = prozentualer Anteil IQ488 im IQ488-CaM-Komplex IQ488-CaMMax = Maximale Sättigung des IQ488 mit CaM [CaM] = Konzentration an Calmodulin KD = Dissoziationskonstante des IQ488-CaM-Komplexes 2.4 Verwendete Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien wurden aus den angegebenen oder anderen handels- üblichen Quellen bezogen und entsprachen den analytischen Reinheitsanforderungen. Pufferlösungen wurden mit H2O bidest aus einer Astacus-Filteranlage (Membrapure) angesetzt. 40 (12) (13)
3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung des Sec61-Komplexes aus Canis familiaris 3.1.1 Fusion der Proben mit dem planaren Bilayer Alle untersuchten Proben des Sec61-Komplexes aus Canis familiaris konnten erst nach Modifikation der Lipidzusammensetzung der Liposomenmembran nach 2.2.9 in den Bi- layer inkorporiert werden. Eine einfache Vermischung der Lipide durch Beschallen der Proben mit Ultraschall mit anschließenden Gefriertau-Zyklen hat sich dabei als nicht ausreichend erwiesen, ein Mega 9-vermitteltes Solubilisieren der Proteoliposomen war zwingend erforderlich. Biochemische Experimente haben gezeigt, dass die für die elektrophysiologischen Versuche verwendeten Translokon-Präparationen nach Modifikation der Lipidzusammensetzung der Liposomenmembran in Anwesenheit von Mega 9 in Be- zug auf die Proteintranslokation funktionell waren (persönliche Kommunikation mit Dr. Martin Jung, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg). Eine essenzielle Voraussetzung für die Fusion eines Proteoliposoms mit dem planaren Bilayer ist das Vorhandensein eines offenen, ionenleitenden Kanals in der Liposomen- membran (2.3.8). Eine Aktivierung der Kanalaktivität kann über einen Vergleich der Fusionsraten vor und nach der entsprechenden Probenbehandlung gezeigt werden. Die cotranslationalen Translokonpräparationen (RM) fusionierten mit cytosolseitig gebunde- nen Ribosomen schlecht mit dem planaren Bilayer. Wurden diese durch Inkubation der Proben mit Puromycin, KCl und GTP abgelöst (2.2.10), so war eine deutliche Zunahme der Fusionsereignisse zu beobachten. Damit kann von einem Induzieren des Kanals durch Lösen der Ribosomen ausgegangen werden. Da die untersuchten Kanäle vor und nach Lösen der Ribosomen aufgrund ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften nicht vonein- ander zu unterscheiden waren, ist eine Kontamination der rauen Mikrosomen mit anderen kanalbildenden Proteinen als Ursache für die beobachtete Aktivität vor Inkubation mit Puromycin, KCl und GTP unwahrscheinlich. Des Weiteren waren die elektrophysiologischen Grundcharakteristika der untersuchten Kanäle aus rauen Mikrosomen vor Ribosomen-Depletion mit denen der posttranslationalen Präparationen identisch. Da- mit liegt nahe, dass in den RM-Proben eine geringe Anzahl nicht-ribosomenassoziierter Sec61-Kanäle vorhanden war und die entsprechenden Mikrosomen spontan mit dem planaren Bilayer fusionierten. Die posttranslationalen Präparationen (PKRM) sowie Proteoliposomen mit aufgerei- nigtem Sec61-Komplex fusionierten gut mit dem planaren Bilayer. Eine Vorinkubation dieser Proben mit einem transportkompetenten Vorstufenprotein wie PPcecA (preprocecropin A, Wirth, 2003) oder Ubc6 (ubiquitin conjugating enzyme 6, Erdmann, 2004) 41
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4.9 Veränderungen durch Ribosomen
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4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
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Literatur Mitra et al. 2005 Mitra,
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