b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

2 Material und Methoden 2.1.3.5 Tom40 Tom40 aus Saccharomyces cerevisiae wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Nikolaus Pfanner (Institut für Biochemie und Molekularbiologie, <strong>Universität</strong> Freiburg) heterolog in Escherichia coli-Zellen exprimiert, aus inclusion bodies naturiert und aufgereinigt. Anschließend wurde das Protein detergensvermittelt in Liposomen (L-α-PC-Typ IV-S, Sigma) rekonstituiert (Becker, 2008). 2.1.3.6 SecYEG-Komplex Der SecYEG-Komplex aus E. coli wurde im Labor von Dr. Ian Collinson (Department of Biochemistry, School of Medical Sciences, University of Bistol) nach Collinson et al. (2001) überexpremiert, aufgereinigt und in Liposomen (L-α-PC, Larodan Fine Chemi- cals, Schweden) rekonstituiert. 2.2 Biochemische Methoden 2.2.1 Flotation im Dichtegradienten Die Trennung von Proteoliposomen und löslichen, nicht mit den Proteoliposomen assoziierten Proteinen erfolgte mit Hilfe eines diskontinuierlichen Nycodenz-Dichtegradienten (Firma Axis-Shield, Norwegen). Dieser hat gegenüber einem herkömmlichen Saccharose- gradienten den Vorteil, dass das Nycodenz osmotisch inaktiv ist. Des Weiteren stellt sich ein Gleichgewichtszustand während der Zentrifugation im Nycodenzgradienten deutlich schneller ein als bei der Verwendung von Saccharose. 50 µl Proteoliposomensuspension wurden in ein 4 ml Zentrifugenrohr (Beckmann) gegeben, mit dem Stufengradienten (siehe Tabelle 2.1) überschichtet und für 90 Minuten in einem MLS-50 Rotor (Beck- man) bei 100000 g und 4°C in einer Optima Max Ultrazentrifuge (Beckman-Coulter) zentrifugiert. Im Anschluss wurden die einzelnen Fraktionen des Gradienten mit einer Pipette abgenommen. Tabelle 2.1: Zusammensetzung des Nycodenz-Dichtegradienten Nycodenz [%] (w/v) Volumen [ml] 2 0,75 5 0,75 10 1,0 20 0,5 40 0,5 Für die Coflotationsexperimente mit Rhodamin-6G-gelabeltem Calmodulin (siehe 3.1.10.1) 20
2.2 Biochemische Methoden wurden die verwendeten Nycodenzlösungen mit 100 mM KCl, 5 mM CaCl2, 10 mM Mops/ Tris pH 7 oder 100 mM KCl, 10 mM EGTA, 10 mM Mops/Tris pH 7 angesetzt. 2.2.2 Proteinfällung mit Trichloressigsäure Für eine Analyse der Membranproteine aus den Liposomen sowie der assoziierten lösli- chen Proteine mittels SDS-Page wurde eine Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) durch- geführt. Dazu wurden die Fraktionen der Nycodenzgradienten mit TCA inkubiert (10 % TCA v/v final) und die Proteine mit einer Tischzentrifuge (Hermle) bei 22000 g und 4°C für 30 Minuten pelletiert. Anschließend wurde der jeweilige Überstand verworfen, das Pellet mit 200 µl -80°C-kaltem Aceton inkubiert und bei 22000 g und -20°C für 30 Minuten zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes folgte das Trocknen des Pellets in einer Speedvac (SVC-100, Savant) bei 40°C. 2.2.3 SDS-Gelelektrophorese Das Pellet wurde in 20 µl Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 18 % (v/v) Glycerin, 1 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau) aufgenommen, bei 40°C für 5 Minuten in einem Thermomixer (Bioer) inkubiert und anschließend auf das Gel aufgetragen. Die SDS-Gele wurden in einem Mini-Gel System (Sigma) gegossen (Laemmli, 1970). Die Proben durchliefen zuerst ein 4 %iges Sammelgel (pH 6,8) bei einer Spannung von 80 V um eine optimale Fokussierung der Proteinbanden zu gewährleisten (Righetti et al., 1990), gefolgt von einem 12 %igen Trenngel (pH 8,8) bei 120 V. Der verwendete Elektrodenpuffer enthielt 192 mM Glycin, 25 mM Tris und 0,1 % SDS (w/v). 2.2.4 Detektion gelabelter Proteine im Polyacrylamidgel Die Proben mit Rhodamin-6-G gelabeltem Calmodulin (3.1.10.1) wurden nach 2.2.3 elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Gele für 30 Minuten in Reinst- wasser gespült und mit einem Versadoc 4000 Imaging System (Biorad) bei UV-Anregung digitalisiert. Danach konnten sie mittels Färbung oder Westernblot weiter analysiert wer- den. Eine Quantifizierung der Proteinmenge geschah mit dem quelloffenen Programm ImageJ. 2.2.5 Anfärbung der Proteine im Polyacrylamidgel Nach abgeschlossener Elektrophorese wurden die Gele für 30 Minuten in Reinstwasser gespült und anschließend mittels kolloidaler Coomassiefärbung nach Kang et al. (2002) 21
Seite 1: Zur Regulation der Proteintransloka
Seite 4 und 5: Inhaltsverzeichnis 2.2.7 Fluoreszen
Seite 7 und 8: 1 Einleitung Eine der wichtigsten F
Seite 9 und 10: 1.2 Die Protein-Translokase des End
Seite 15 und 16: 1.3 Das Endoplasmatische Retikulum
Seite 17 und 18: 1.4 Calmodulin konnten zeigen, dass
Seite 19 und 20: 1.4 Calmodulin mit der N-terminalen
Seite 21 und 22: wie Lanthan? 1.5 Zielsetzung der vo
Seite 23 und 24: 2.1 Verwendete Proben Abbildung 2.1
Seite 25: 2.1 Verwendete Proben pIVEX2.3MCS),
Seite 29 und 30: 2.2 Biochemische Methoden Peptid in
Seite 31 und 32: 2.3 Elektrophysiologische und bioph
Seite 35 und 36: 2.3.5 Liquid junction Potenziale 2.
Seite 45 und 46: ω1 = � 4DτD π ω1 = Fokusradiu
Seite 47 und 48: 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung
Seite 49 und 50: 3.1 Charakterisierung des Sec61-Kom
Seite 77 und 78:
3.2 Charakterisierung der rauen Mik
Seite 79 und 80:
Seite 81 und 82:
Seite 83 und 84:
4 Diskussion 4.1 Fusion der Proben
Seite 85 und 86:
4.2 Schaltverhalten und Leitwerte d
Seite 87 und 88:
Seite 89 und 90:
Seite 91 und 92:
4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
Seite 93 und 94:
4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
Seite 95 und 96:
4.6 Interaktion mit Lanthan- und Al
Seite 97 und 98:
4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
Seite 99 und 100:
Seite 101 und 102:
Seite 103 und 104:
4.9 Veränderungen durch Ribosomen
Seite 105 und 106:
4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
Seite 107 und 108:
• Ribosomen führen in nanomolare
Seite 109 und 110:
Literatur Beauvois et al. 2004 Beau
Seite 111 und 112:
Literatur Colombo et al. 2005 Colom
Seite 113 und 114:
Literatur Grabarek 2006 Grabarek, Z
Seite 115 und 116:
Literatur Kappen et al. 1973 Kappen
Seite 117 und 118:
Literatur Mitra et al. 2005 Mitra,
Seite 119 und 120:
Literatur Portzehl et al. 1964 Port
Seite 121 und 122:
Literatur Song et al. 2000 Song, W.
Seite 123 und 124:
Literatur Weihofen et al. 2000 Weih
Seite 125 und 126:
Abbildungsverzeichnis Abbildungsver
Seite 127 und 128:
Tabellenverzeichnis Tabellenverzeic
Seite 129:
PPcecA Preprocecropin A PS Phosphat
Alle anzeigen

b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?