b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück
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4 Diskussion<br />
tuierten Tom 40 aus S. cerevisiae und Protein-freien Liposomen kann hingegen keine<br />
Flotation von Calmodulin beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Calmodulin<br />
spezifisch mit der α, β- oder γ-Untereinheit des Sec61 interagiert und das die Bindestel-<br />
le von cytosolischer oder luminaler Seite zugänglich sein muss. Des Weiteren assoziiert<br />
Calmodulin in diesen Experimenten nicht nur in Anwesenheit von freiem Ca 2+ , sondern<br />
ebenfalls als Calcium-freies ApoCalmodulin mit dem Sec61-Komplex. Diese Beobach-<br />
tung steht im Widerspruch zu den Ergebnissen der elektrophysiologischen Versuche<br />
und FCS-Experimente, die eine strikt Calcium-abhängige Interaktion von CaM mit<br />
dem Sec61-Komplex bzw. dem isolierten Sec61αIQ-Peptid zeigen. Ein möglicher Erklä-<br />
rungsansatz ist, dass CaM auch an eine Bindestelle für ER-luminale EF-Hand-Proteine<br />
am Sec61-Komplex binden kann. Computergestützte Analysen haben in diesem Zu-<br />
sammenhang eine luminale CaM-Bindestelle auf der Sec61α-Untereinheit vorhergesagt<br />
(3.1.10.3). Biochemische Untersuchungen haben ergeben, dass die luminalen EF-Hand-<br />
Proteine Reticulocalbin und Calumenin über Sec63 mit dem Translokon interagieren<br />
(Tyedmers et al., 2005).<br />
In Stromspuren aus Einzelkanalexperimenten lässt sich beobachten, dass der Sec61-<br />
Kanal aus RM-Präparationen in Anwesenheit freier Calciumionen nach symmetrischer<br />
Zugabe von 500 nM CaM fast vollständig schließt (3.1.10.2). Der für alle im Rahmen<br />
der vorliegenden Arbeit untersuchten Proben charakteristische Leckstrom tritt nach<br />
Calmodulin-Zugabe nicht mehr auf. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der ent-<br />
sprechende Ionenfluss über einen Effektor-induzierbaren Gating-Mechanismus reguliert<br />
werden kann. Ob die verbleibende Kanalaktivität in Anwesenheit von Ca 2+ -CaM ei-<br />
nem Schalten im Leckleitwert oder im Hauptleitwert zuzuordnen ist, kann jedoch nicht<br />
zweifelsfrei geklärt werden. Wird freies Ca 2+ in der verwendeten KCl-Elektrolytlösung<br />
mit Hilfe von EGTA chelatiert, so ist keine Veränderung im Offenzustand des Kanals<br />
nach CaM-Zugabe zu beobachten. Der Calmodulin-Effekt zeigt sich damit als strikt<br />
Calcium-abhängig.<br />
In Anwesenheit freien Calciums kann eine deutliche Abnahme der Offenwahrscheinlich-<br />
keit des Sec61-Kanals aus rauen Mikrosomen nach CaM-Zugabe festgestellt werden.<br />
In Abwesenheit von Ca 2+ -Ionen tritt keine Veränderungen nach CaM-Zugabe auf. Des<br />
Weiteren ist in Kontrollexperimenten mit Strom-Spannungsrampen in Anwesenheit von<br />
Calmodulin ein Schließen des Kanals erst nach Zugabe freier Ca 2+ -Ionen zu beobach-<br />
ten. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nicht nur die Bindung von Calmodulin an das<br />
Translokon, sondern auch die Bindung von Ca 2+ an CaM und damit dessen Aktivierung<br />
essenziell für die Regulation des Offenzustandes und der Ionenleitfähigkeit des Kanals<br />
ist.<br />
Untersuchungen mit Strom-Spannungsrampen zeigen, dass 150-200 nM CaM ausreichen,<br />
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