b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

2.2 Biochemische Methoden
wurden die verwendeten Nycodenzlösungen mit 100 mM KCl, 5 mM CaCl2, 10 mM
Mops/ Tris pH 7 oder 100 mM KCl, 10 mM EGTA, 10 mM Mops/Tris pH 7 angesetzt.
2.2.2 Proteinfällung mit Trichloressigsäure
Für eine Analyse der Membranproteine aus den Liposomen sowie der assoziierten lösli-
chen Proteine mittels SDS-Page wurde eine Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) durch-
geführt. Dazu wurden die Fraktionen der Nycodenzgradienten mit TCA inkubiert (10 %
TCA v/v final) und die Proteine mit einer Tischzentrifuge (Hermle) bei 22000 g und
4°C für 30 Minuten pelletiert. Anschließend wurde der jeweilige Überstand verworfen,
das Pellet mit 200 µl -80°C-kaltem Aceton inkubiert und bei 22000 g und -20°C für 30
Minuten zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes folgte das Trocknen des Pellets
in einer Speedvac (SVC-100, Savant) bei 40°C.
2.2.3 SDS-Gelelektrophorese
Das Pellet wurde in 20 µl Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl pH 6,8, 2 % (w/v) SDS,
18 % (v/v) Glycerin, 1 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau)
aufgenommen, bei 40°C für 5 Minuten in einem Thermomixer (Bioer) inkubiert und
anschließend auf das Gel aufgetragen. Die SDS-Gele wurden in einem Mini-Gel System
(Sigma) gegossen (Laemmli, 1970). Die Proben durchliefen zuerst ein 4 %iges Sammelgel
(pH 6,8) bei einer Spannung von 80 V um eine optimale Fokussierung der Proteinbanden
zu gewährleisten (Righetti et al., 1990), gefolgt von einem 12 %igen Trenngel (pH 8,8)
bei 120 V. Der verwendete Elektrodenpuffer enthielt 192 mM Glycin, 25 mM Tris und
0,1 % SDS (w/v).
2.2.4 Detektion gelabelter Proteine im Polyacrylamidgel
Die Proben mit Rhodamin-6-G gelabeltem Calmodulin (3.1.10.1) wurden nach 2.2.3
elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Gele für 30 Minuten in Reinst-
wasser gespült und mit einem Versadoc 4000 Imaging System (Biorad) bei UV-Anregung
digitalisiert. Danach konnten sie mittels Färbung oder Westernblot weiter analysiert wer-
den. Eine Quantifizierung der Proteinmenge geschah mit dem quelloffenen Programm
ImageJ.
2.2.5 Anfärbung der Proteine im Polyacrylamidgel
Nach abgeschlossener Elektrophorese wurden die Gele für 30 Minuten in Reinstwasser
gespült und anschließend mittels kolloidaler Coomassiefärbung nach Kang et al. (2002)
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