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2 Material und Methoden Aus den so erhaltenen Umkehrpotenzialen wurden mit dem Programm Mathcad 2001 (Mathsoft) nach Gleichung (6) die relativen Selektivitäten bestimmt. Diese Methode zur Bestimmung des Umkehrpotenziales hat den Nachteil dass Leckleit- fähigkeiten von Kanal und Membran mit einfließen. Daher wurde Urev zusätzlich aus der Stromdifferenz vor und nach einem Schaltereignis ermittelt. Dazu wurde ein wie unter 2.3.9 beschriebenes Messprotokoll unter asymmetrischen Elektrolytbedingungen aufgenommen und die durch Schaltereignisse des Kanals verursachten Stromänderungen (dI) ausgewertet. Anschließend wurden mit der Software Origin 7.0 Häufigkeitshistogramme für die Stromänderungen erstellt und dabei die angelegten Klemmspannungen getrennt voneinander betrachtet. Häufungen in den Histrogrammen wurden mit Gaußfunktionen angepasst und die zugehörigen Maxima gegen die entsprechenden Klemmspannungen zu einer Strom-Spannungskennlinie aufgetragen. Haupt- und Unterleitwert wurden mit Ausgleichsfunktionen angepasst und die Umkehrpotenziale als Schnittpunkte mit der x-Achse abgelesen. 2.3.14 Abschätzung des Porendurchmessers aus dem Leitwert Nach Hille (2001), Seite 352 kann der Durchmesser eines Kanals abgeschätzt werden wenn sein Leitwert bekannt ist. Dabei wird der Kanal als ein idealisierter Zylinder mit Verengungszone und beidseitig vorgelagerten Vestibülen angenommen. Ist dieser Kanal mit einer Lösung mit spezifischem Widerstand ρ gefüllt, so ergibt sich sein Ge- samtwiderstand aus Radius, Länge und Widerstand der Restriktionszone sowie dem Zugangswiderstand für die Ionen (Raccess), d.h. dem Widerstand der Vestibüle. RK = RR + Raccess = � l + πr 2 � ρ πr 2 RK = Widerstand des Kanals l = Länge der Restriktionszone RR = Widerstand der Restriktionszone r = Radius der Restriktionszone Raccess = Widerstand der Vestibüle ρ = spez. Widerstand der Lösung Setzt man für den Widerstand RK den reziproken Leitwert ein und löst Gleichung (7) nach r auf, so kann der Porendurchmesser abgeschätzt werden: 36 d = ρG π � π 2 + � �π d = Durchmesser des Kanals G = Leitwert des Kanals 2 � 2 + 4πl � ρG (7) (8)
2.3 Elektrophysiologische und biophysikalische Methoden Da über die Länge der Verengungszone im Fall des Sec61-Kanals keine Informationen vorlagen, wurden verschiedene Werte zwischen 5 Å und 50 Å bei vollständiger Durch- spannung der Membran berücksichtigt. Die spezifische Leitfähigkeit des verwendeten Puffers (250 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7) wurde mit einem Konduktometer (WTW LF3000) mit 31,5 mS · cm −1 bestimmt, was einem spezifischen Widerstand von 31,7 Ω · cm entspricht. Smart et al. (1997) konnten zeigen, das der spezifische Wider- stand einer Lösung in den Porenregionen von Kanälen mit bekannter Kristallstruktur deutlich höher ist als im sie umgebenden Medium. Entsprechend wurde der Messwert um den von Smart et al. (1997) vorgeschlagenen Faktor von 5 auf 158,5 Ω · cm korrigiert. Die Berechnung der Porengröße erfolgte mit dem Programm Mathcad 2001. 2.3.15 Berechnung der Offenwahrscheinlichkeit Den Schaltereignissen eines Kanals liegen Veränderungen der Proteinkonformation zu- grunde. Dabei entspricht jeder stabile Zustand (im idealisierten Fall nur zwei: offener und geschlossener Kanal) einem Energieminimum. Für die Überwindung der Energie- barriere zum nächsten Offenzustand reicht im Allgemeinen die thermische Energie des Systems aus. Der Offenzustand eines Kanals kann von der angelegten Spannung abhän- gig sein, wenn Ladungen im Protein auf das angelegte elektrische Feld reagieren (gating charges; Hille, 2001, Seite 56ff., 603ff.) und damit die Energiebarriere zwischen zwei stabilen Offenzuständen herabgesetzt wird. Um die Offenwahrscheinlichkeiten zu bestimmen, wurden die Halbkammern symme- trisch perfundiert, die Klemmspannungen wie unter 2.3.9 geschildert für eine Minute angelegt und die resultierende Stromantwort kontinuierlich aufgezeichnet. Zur Auswer- tung wurde jeweils der mittlere Strom des maximalen Offenzustandes zum Mittel über die gesamte Minute ins Verhältnis gesetzt und die so erhaltenen Offenwahrscheinlich- keiten gegen die angelegten Klemmspannungen aufgetragen. Sollte der Einfluss eines Effektors auf die spannungsabhängige Offenwahrscheinlichkeit des Kanals untersucht werden, so wurde erst ein Referenzprotokoll ohne Effektor aufgenommen. Die Offen- wahrscheinlichkeit wurde daraufhin als Quotient aus dem mittleren Strom der einminü- tigen Stromspur nach Zugabe des Effektors und dem mittleren Strom des maximalen Offenzustandes vor Effektorzugabe berechnet. 2.3.16 Mean-Variance Plot Für eine Betrachtung von zeitlich sehr dicht aufeinander folgenden Schaltereignissen hat sich die Mean-Variance Darstellung der Stromdaten als sehr hilfreich erwiesen. Mit der herkömmlichen Datendarstellung als Stromspur oder Stromhistogramm lassen sich 37
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Seite 103 und 104:
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4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
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• Ribosomen führen in nanomolare
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Literatur Beauvois et al. 2004 Beau
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Literatur Colombo et al. 2005 Colom
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Literatur Grabarek 2006 Grabarek, Z
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Literatur Kappen et al. 1973 Kappen
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Literatur Mitra et al. 2005 Mitra,
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