b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

2 Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Verwendete Proben
Ein Großteil der verwendeten Proben wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Richard
Zimmerman von Dr. Martin Jung (Fachrichtung Medizinische Biochemie und Moleku-
larbiologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg) biochemisch charakterisiert,
aufgereinigt oder synthetisiert und freundlicherweise für die durchgeführten Experimen-
te zur Verfügung gestellt.
2.1.1 Proben des Translokon-Komplexes aus Canis familiaris
2.1.1.1 Raue Mikrosomen, RM
Die Präparation der rauen Mikrosomen geschah nach Watts et al. (1983) aus Hunde-
Pankreas (Canis familiaris). Das Ergebnis dieser Arbeiten waren Vesikel, die den Sec61-
Komplex sowie alle weiteren am Translokon beteiligten Membranproteine des Endo-
plasmatischen Retikulums (Sec62, Sec63, signal recognition particle receptor SRP-R, si-
gnal peptidase complex SPC, translocating chain-associating membrane Protein TRAM,
translocon-associated protein complex TRAP, oligosaccharyl transferase OST) sowie
lösliche Proteine des ER-Lumens und des Cytosols (signal recognition particle SRP)
enthielten. Auf der cytosolischen Seite war das Translokon in diesen Präparationen mit
Ribosomen mit undefinierten naszierenden Polypeptidketten assoziiert. Die Proben la-
gen in einer Konzentration von ca. 10 mg/ml in Saccharose-Puffer (200 mM Saccharose,
20 mM Hepes/KOH, pH 7.5, 20 mM KCl und 2 mM Mg(Ac)2) vor.
2.1.1.2 Puromycin-Kalium gewaschene raue Mikrosomen, PKRM
Die PKRM-Proben wurden aus RM-Präparationen gewonnen. Um die Ribosomen zu
entfernen wurden diese durch Inkubation in 1 mM Puromycin, 500 mM KCl abgelöst und
anschließend durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert (Görlich und Rapoport,
1993). In der Zusammensetzung der Membranproteine entsprechen diese Liposomen
den RM Präparationen. Die Proben lagen in einer Konzentration von ca. 10 mg/ml in
Saccharose-Puffer (200 mM Saccharose, 20 mM Hepes/KOH, pH 7.5, 20 mM KCl und
2 mM Mg(Ac)2) vor.
2.1.1.3 Proteoliposomen mit aufgereinigtem Sec61-Komplex
Die Isolierung des Sec61-Komplexes geschah nach Görlich und Rapoport (1993) aus
rauen Mikrosomen. Nach der Aufreinigung wurden die Proteine detergensvermittelt in
Liposomen mit definierter Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Dazu wurde das ge-
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