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3.1 Charakterisierung des Sec61-Komplexes aus Canis familiaris
so kann man anhand der Leitwerte von einer Veränderung des Porendurchmessers von
5-7 Å für den Hauptleitwert und von 12-14 Å für den Unterleitwert ausgehen. Der
maximale Porendurchmesser liegt im Bereich von 30-34 Å.
3.1.10 Regulation des Sec61-Komplexes durch Calmodulin
3.1.10.1 Biochemische Ergebnisse
Es ist bekannt, dass das cytosolische Protein Calmodulin (CaM) viele Ionenkanäle Calci-
umabhängig reguliert (siehe 1.4). Um zu untersuchen ob CaM mit dem Sec61-Komplex
interagiert wurden Coflotationsexperimente durchgeführt. 50 µl Proteoliposomen mit
aufgereinigtem, rekonstituierten Sec61-Komplex wurden in An- und Abwesenheit frei-
er Ca 2+ -Ionen mit 800 ng Rhodamin-6G-gelabeltem Calmodulin (CaM-R6G) inkubiert
und über einen diskontinuierlichen Nycodenzgradienten flotiert (2.2.1). In Kontrollex-
perimenten wurden die für die Rekonstitution des gereinigten Sec61-Komplexes verwen-
deten, Protein-freien L-α-PC Liposomen sowie Proteoliposomen mit der aufgereinigten
Proteintranslokase der äußeren Mitochondrienmembran Tom40 aus S. cerevisiae und
dem aufgereinigten Sec61-homologen SecYEG-Komplex aus der Plasmamembran von
E. coli auf Interaktionen mit CaM untersucht. Die Ergebnisse der Experimente sind in
Abbildung 3.10 dargestellt.
Da Proteoliposomen eine geringere Dichte als lösliche oder denaturierte Proteine besit-
zen, wandern sie im Gradienten in entsprechende Fraktionen und es kommt zu einer
Auftrennung der Probe. Findet eine Bindung der löslichen Proteine an die rekonstitu-
ierten Membranproteine statt, so kann eine Colokalisation im Gradienten beobachtet
werden, während freie lösliche Proteine in den dichten Fraktionen des Gradienten ver-
bleiben.
Calmodulin flotiert in Anwesenheit von freiem Calcium mit den Proteoliposomen mit
aufgereinigtem Sec61-Komplex aus den hohen Nycodenzdichten in die Fraktionen mit
niedrigen Dichten (Abbildung 3.10 a). Wird Ca 2+ im verwendeten KCl-Puffer (100 mM
KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7) mit 10 mM EGTA zu einer Konzentration von ca. 40 pM
chelatiert (Portzehl et al., 1964, http://www.entropy.brneurosci.org/egta.html), so kann
ebenfalls eine Colokalisation des Calmodulins mit Sec61α im Gradienten beobachtet
werden (Abbildung 3.10 b). Dabei befinden sich in Anwesenheit von Ca 2+ 74 % des
eingesetzten Calmodulins und 98 % des eingesetzten Sec61α in den Nycodenzdichten
2 %, 5 % und 10 %, in Abwesenheit von Calcium lokalisieren 58 % des CaM und 94 %
des Sec61α in diesen Fraktionen.
In Kontrollexperimenten kann weder eine Coflotation von CaM mit Proteoliposomen
mit aufgereinigtem, rekonstituierten Tom40, noch mit aufgereinigtem, rekonstituierten
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