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2 Material und Methoden Gabs = I U Grel = |dI| U I = Strom U = Klemmspannung Gabs = Absoluter Leitwert Grel = Relativer Leitwert Im Folgenden ist, soweit nicht gesondert erwähnt, mit Leitwert immer der relative Leit- wert bezeichnet. Der Leitwert eines Kanals ist abhängig von seinen strukturellen Eigenschaften wie dem Durchmesser der Vestibüle und der Verengungszone (siehe 2.3.14) oder den geladenen oder polaren Aminosäureresten in der Porenregion. Er variiert mit dem Offenzustand des Kanals, aber im Fall von Translokasen eventuell auch mit der Struktur des in Ver- engungszone oder Vestibül befindlichen Translokationssubstrates. Die Datenaufnahme zur Auswertung des Leitwertes erfolgte unter symmetrischen Bedin- gungen, um einen linearen Zusammenhang zwischen Strom und angelegter Klemmspan- nung zu gewährleisten. Dafür wurden nach erfolgreicher Fusion eines Probenliposoms (siehe 2.3.8) mit dem planaren Bilayer beide Messkammern perfundiert. Anschließend wurden mit dem Programm Axoscope 9.0 (Axon Instruments) verschiedene Klemmspan- nungen angelegt und die Stromdaten mit einer Samplingfrequenz von 5 kHz gespeichert. Die Stromspuren wurden über einen Spannungsbereich von -60 mV bis +60 mV mit einer Inkrementierung von 5 mV aufgenommen. Dabei wurden abwechselnd konstante positive und negative Klemmspannungen ansteigend für einen Zeitraum von 60 Sekun- den angelegt, getrennt von einer Pause von 30 Sekunden. Da der Sec61-Komplex bereits bei Klemmspannungen ab ±55 mV ein gestörtes Schaltverhalten zeigte, erfolgte eine Datenaufnahme bei höheren Membranpotenzialen nur in Ausnahmefällen. Die Datenauswertung erfolgte mit dem Programm Ephys5 (Dr. Thomas Steinkamp, Fachbereich Biologie, <strong>Universität</strong> <strong>Osnabrück</strong>). Dabei hat es sich als sinnvoll erwiesen zur eindeutigen Identifizierung von Schaltereignissen ein Histogramm über die Stromdaten zu erstellen, mit dessen Hilfe eine klare Trennung der unterschiedlichen Stromniveaus auch bei niedrigen Klemmspannungen (kleinem dI) möglich war. Aus den mit Ephys5 erhaltenen Stromdaten wurden mit dem Programm Excel 2003 die jeweiligen Leitwerte errechnet. Diese Daten konnten anschließend mit dem Programm 32 (1) (2)
2.3 Elektrophysiologische und biophysikalische Methoden Origin 7.0 weiterverarbeitet werden. Dazu wurden die Leitwerte aller untersuchten Klemmspannungen in Klassen zusammengefasst und gegen ihre Häufigkeit als Histo- gramm aufgetragen. Häufungen innerhalb der so erhaltenen Leitwertverteilung konnten mit Gaußfunktionen angepasst werden. Anhand der Maxima der Anpassungen erfolgte die Bestimmung von Haupt- und Unterleitwert. Im Folgenden bezieht sich der Begriff Hauptleitwert auf die am häufigsten auftretende Stromänderung. 2.3.10 Leitwertsättigung Mit zunehmender Ionenkonzentration der eingesetzten Elektrolytlösungen nimmt der Leitwert eines Kanals kontinuierlich zu. Dieser Zusammenhang ist dabei nur bis zu einer bestimmten Salzkonzentration annähernd linear. Trägt man die Aktivitäten (siehe 2.3.11) der Elektrolytlösungen gegen die zugehörigen Leitwerte auf, so nähert sich die Funktion asymptotisch einem Maximalleitwert (GMax) an. Stellt man sich die Pore eines single-file-Ionenkanals als eine Reihe von Ionenbindungsstellen vor, so sind bei der Elektrolytaktivität, bei der der halbmaximale Leitwert erreicht ist (KM), die Hälfte dieser Bindungsstellen besetzt, während beim Erreichen des Maximalleitwertes alle Stellen besetzt sind. Nach Hille (2001), Seite 472 kann dieser Zusammenhang analog zur Enzymkinetik be- schrieben werden: [S] G = GMax [S] + KM G = Leitwert GMax = Maximalleitwert [S] = Aktivität des Ions S KM = Aktivität des Ions S, bei dem ein halbmaximaler Leitwert erreicht ist 2.3.11 Aktivitäten der Elektrolytlösungen Die vereinfachende Annahme, dass sich die Ionen einer Elektrolytlösung nicht gegensei- tig beeinflussen, ist nur bei niedrigen Salzkonzentrationen zulässig. Bei höheren Kon- zentrationen nehmen die Interaktionen der Ionen zu, während ihr chemisches Potenzial abnimmt. Deshalb verwendet man bei entsprechenden Experimenten statt der Konzen- tration einer Lösung deren Aktivität, die sich aus der Multiplikation der Konzentration mit dem Aktivitätskoeffizienten ergibt. Dieser Effekt ist bei identischer Molarität verschiedener Salzlösungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Daher ist es für die Vergleichbarkeit elektrophysiologischer Ergeb- (3) 33
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4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
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4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
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4.9 Veränderungen durch Ribosomen
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4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
Seite 107 und 108:
• Ribosomen führen in nanomolare
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Literatur Beauvois et al. 2004 Beau
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Literatur Colombo et al. 2005 Colom
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Literatur Grabarek 2006 Grabarek, Z
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Literatur Kappen et al. 1973 Kappen
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Literatur Mitra et al. 2005 Mitra,
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Literatur Portzehl et al. 1964 Port
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Literatur Song et al. 2000 Song, W.
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Literatur Weihofen et al. 2000 Weih
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Tabellenverzeichnis Tabellenverzeic
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