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2 Material und Methoden angefärbt. Dazu wurden sie über Nacht in Färbelösung (10 % (v/v) Ethanol, 5 % (w/v) Al2O12S3, 2 % (v/v) Phosphorsäure, 0,02 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue 250) inkubiert und danach mit Entfärbelösung (10 % (v/v) Ethanol, 2 % (v/v) Phosphorsäure) so weit wie nötig entfärbt. Abschließend folgte die Digitalisierung der Gele mit einem Durchlichtscanner (Epson 4870). 2.2.6 Westernblot Für eine eindeutige Detektion der Proteine mittels Westernblot wurden die Proben elektrophoretisch aufgetrennt (2.2.3) und das Gel danach für 30 Minuten in Transferpuffer (192 mM Glycerin, 25 mM Tris, 20 % (v/v) Methanol) geschwenkt. Anschließend wurden die Proteine in einer semi-dry Blotkammer (Biometra) für 2 Stunden bei 250 mA auf PVDF-Membran (Amersham) transferiert (Towbin et al., 1979). Um unspezifische Wechselwirkungen mit den Antikörpern zu verringern, folgte eine einstündige Inkubati- on der Membran in 4 %iger Milchpulverlösung (w/v) in TBS-T Puffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl pH 8, 0,05 % (v/v) Tween 20) bei Raumtemperatur. Darauf folgte eine Inkubation mit primärem Antikörper in 4 %iger Milchpulverlösung (w/v) in TBS-T Puffer über Nacht bei 4°C. Nach mehrmaligem Spülen mit TBS-T Puffer wurde der sekundäre Antikörper (Peroxidase-gekoppelter Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziege, Sigma) für eine Stunde bei Raumtemperatur an den primären Antikörper gebun- den. Nach weiteren Spülschritten und Induzierung der Chemolumineszenz durch Zugabe von Luminol (ECL Western Blot Detection Kit, Amersham) folgte die Belichtung der Membran auf einem Filmbogen (Kodak BioMax), die automatisierte Filmentwicklung (Kodak Filmentwickler) und das Digitalisieren mit einem Scanner (Epson 4870). Die Quantifizierung der Proteinmenge geschah mit dem Programm ImageJ. 2.2.7 Fluoreszenzmarkierung des Sec61αIQ-Peptides Für die Bindungsstudien mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie wurde das kom- merziell synthetisierte Sec61αIQ-Peptid aus Canis familiaris (Sequenz: -16LPEIQKPERKIQFKEKVLWTAITLFI41-C, GenScript) mit einem Fluoreszenzfarb- stoff gelabelt (Atto488, Atto-Tec). Der Maleimid-gekoppelte Farbstoff wurde dabei über eine Thiolether-Bindung an ein terminal in das Peptid eingebrachte Cystein gekoppelt. Dazu wurde 1 mg Sec61αIQ-Peptid für 2 Stunden in 1 ml 150 mM NaCl, 100 mM Na2HPO4, 100 mM KH2PO4 pH 7, 1 mM TCEP, 40 % DMSO mit einem 20-fachen mola- ren Überschuss an Atto488-Maleimid bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Peptid mittels Verdünnung und Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (Hermle) bei 22000 g und 4°C für 30 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das 22
2.2 Biochemische Methoden Peptid in 1 ml 150 mM NaCl, 100 mM Na2HPO4, 100 mM KH2PO4 pH 7, 1 mM TCEP, 40 % Acetonitril resuspendiert. 2.2.8 Reinigung des gelabelten Sec61αIQ-Peptides mittels HPLC und Massenspektrometrie Die Aufreinigung des Atto488-gelabelten IQ-Peptides (IQ488) und die Entfernung des freien Farbstoffes geschah mittels Reversed-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatogra- fie (RP-HPLC) und anschließender Massenspektrometrie. Dabei wurde die Probe in einer Agilent 1100 RP-HPLC mit einer C4-Säule nach ihrer Hydrophobizität aufgetrennt. Es wurde mit einem kontinuierlichen Gradienten von 5 % Acetonitril, 95 % H20, 0,03 % TFA zu 80 % Acetonitril, 20 % H20, 0,03 % TFA über einen Zeitraum von 23 Minuten eluiert und das Eluat im Abstand von 30 Sekunden aliquotiert. Im An- schluss wurden alle Proben mit einem Esquire HCT (Bruker Daltonics) Elektrospray- Ionisations-Massenspektrometer (ESI-MS) untersucht. Bei dieser Technik werden die Probenmoleküle ionisiert, in die Gasphase überführt und elektrophoretisch in eine Io- nenfalle geleitet, wo die Massendetektion stattfindet. Die erhaltenen Massenspektren wurden mit der Software Biotools 3.1 (Bruker Daltonics), Excel 2003 (Microsoft) und Origin 7.0 (Microcal) ausgewertet. Die das IQ-Peptid enthaltenden Proben wurden vereinigt, lyophylisiert, in 100 mM KCl, 0,1 % Triton X-100, 10 mM Mops/Tris pH 7 resuspendiert und bei -80°C gelagert. Für die Experimente (2.3.17) wurden die Aliquots mit 100 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 zu einer Endkonzentration von 100 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7, 5 nM IQ488, 0,005 % Triton X-100 verdünnt und für eine Stunde bei 4°C und 100000 g in einer Optima-L90k-Ultrazentrifuge (Beckman-Coulter) zentrifugiert. CaCl2- oder EGTA wurde aus Stammlösungen zu finalen Konzentrationen von 4 mM CaCl2 bzw. 1 mM EGTA zugegeben. 2.2.9 Modifikation der Lipidkomposition der Probenliposomen Obwohl die zu untersuchenden Membranproteine bereits in Proteoliposomen vorlagen (siehe 2.1), erwiesen sie sich als ungeeignet für Messungen im planaren Bilayer System. Dieses konnte durch eine Solubilisierung der Proteoliposomen mit Detergens, einem Vermischen mit zusätzlichem Lipid und einer anschließenden Entfernung des Detergens mittels Dialyse deutlich verbessert werden. Für diesen Verdünnungsschritt wurde L-α- Phosphatidylcholin aus Eigelb (Larodan Fine Chemicals, Schweden) mit einer Konzen- tration von 50 mg/ml in Methanol-Chloroform (Verhältnis 1:1) gelöst und bei -20°C gelagert. Um eine Oxidation der Lipide zu verhindern wurde die Lösung mit Argon 23
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3.2 Charakterisierung der rauen Mik
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3.2 Charakterisierung der rauen Mik
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4 Diskussion 4.1 Fusion der Proben
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4.2 Schaltverhalten und Leitwerte d
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4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
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4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
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4.6 Interaktion mit Lanthan- und Al
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4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
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Seite 103 und 104:
4.9 Veränderungen durch Ribosomen
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4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
Seite 107 und 108:
• Ribosomen führen in nanomolare
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Literatur Beauvois et al. 2004 Beau
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Literatur Colombo et al. 2005 Colom
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Literatur Grabarek 2006 Grabarek, Z
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Literatur Kappen et al. 1973 Kappen
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Literatur Mitra et al. 2005 Mitra,
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Literatur Portzehl et al. 1964 Port
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