b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

2 Material und Methoden
überschichtet. Aus einem Aliquot dieser Stammlösung wurde eine Liposomensuspensi-
on hergestellt, dazu die Lösungsmittel mit einer Membranvakuumpumpe (Vaccubrand
MZ2C) für 30 Minuten evaporiert und das trockene Lipid mit 50 mM KCl, 10 mM
Mops/Tris pH 7 zu einer Konzentration von 20 mg/ml resuspendiert. Die Proben wur-
den in einem Verhältnis von 3:2 mit dieser Liposomensuspension sowie mit Mega 9
(Nonanoyl-N-Methylglucamid) zu einer Endkonzentration von 80 mM gemischt und die
entstandenen Mischmizellen für einige Minuten inkubiert. Dabei lag die Konzentration
des Mega 9 3,2-fach über der cmc (critical micellar concentration, für Mega 9: 25 mM).
Um das Detergens wieder aus dem Ansatz zu entfernen, wurde dieser abschließend ca.
2 Stunden bei Raumtemperatur und schließlich über Nacht bei 4°C gegen 5 l 50 mM
KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 dialysiert. Die Ausschlussgröße der verwendeten Dialyse-
schläuche (Spectrum Laboratories) betrug 3,5 kDa. Die Liposomen wurden aliquotiert
(10 µl) und nach Schockfrosten in Flüssigstickstoff bei -80°C gelagert.
2.2.10 Induzieren des Sec61-Kanals in RM-Präparationen
Für eine erfolgreiche Fusion der Liposomen mit den planaren Bilayer nach herkömmli-
cher Methode (siehe 2.3.8) ist ein offener Kanal erforderlich. Um diese Ausgangssituation
zu schaffen mussten die Ribosomen von den rauen Mikrosomen aus C. familiaris und
S. cerevisiae abgelöst werden. Dazu wurden die Probenaliquots für ca. 15 Minuten mit
500 µM Puromycin (Serva), 300 mM KCl und 1 mM GTP inkubiert. Puromycin be-
wirkt in Anwesenheit von GTP als Analogon der Aminoacyl-tRNA einen Abbruch der
Kettensynthese, gefolgt vom Freisetzen der Polypeptidkette und der Dissoziation der
Untereinheiten des Ribosoms (Darken, 1964, Adelman et al., 1973). Die hohe Salzkon-
zentration bewirkt ein Lösen der ribosomalen Untereinheiten vom Translokon (Adelman
et al., 1973). Danach konnte der Sec61-Komplex aus RM-Präparationen bei Lagerung
um 4°C im Eisbad für mehrere Tage erfolgreich mit dem planaren Bilayer fusioniert
werden. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurde täglich
ein neues Probenaliquot verwendet.
2.3 Elektrophysiologische und biophysikalische Methoden
2.3.1 Die planare Bilayer Technik
Bei der planaren Bilayer Technik handelt es sich um eine Abwandlung der Patch-Clamp-
Methode, die es erlaubt, einzelne in den Bilayer fusionierte kanalbildende Membranpro-
teine in einer definierten Lipidumgebung elektrophysiologisch zu erfassen. Dabei wird
über Elektroden ein konstantes Membranpotenzial an den Bilayer angelegt (voltage
24