b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück
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ω1 =<br />
� 4DτD<br />
π<br />
ω1 = Fokusradius<br />
D = Diffusionskoeffizient Fluorescein<br />
τD = Diffusionszeit Fluorescein<br />
2.3 Elektrophysiologische und biophysikalische Methoden<br />
ein Fokusradius von ω1=190 nm. Der Strukturparameter κ betrug 4,5 für alle durchge-<br />
führten Experimente. Mit<br />
V = 2π · ω1 2 · κω1<br />
V = Fokusvolumen<br />
ω1 = Fokusradius<br />
κ = Strukturparameter<br />
ergibt sich ein Fokusvolumen von 0,194 fl.<br />
Alle Messungen wurden in 100 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7, 0,005 % Triton X-100<br />
und 4 mM CaCl2 bzw. 1 mM EGTA durchgeführt (siehe 2.2.7). Die Konzentration des<br />
IQ488-Peptides in den Probenansätzen lag für alle durchgeführten Versuche bei 5 nM<br />
(≈ 5 Moleküle im Fokusvolumen). Für die Bindungsstudien wurden die Diffusionszei-<br />
ten für das IQ488-Peptid und den gesättigten IQ488-CaM-Komplex (bei 11,2 µM CaM)<br />
sowie den gesättigten IQ488-GST-CaM-Komplex (bei 7,4 µM GST-CaM) über ein Ein-<br />
Komponenten-Modell der Autokorrelationsfunktion nach<br />
G(τ) = 1 +<br />
�<br />
1 +<br />
T · e −τ<br />
τ T<br />
1 − T<br />
�<br />
1<br />
N<br />
1<br />
1 + τ<br />
τD<br />
1<br />
�<br />
1 + τ<br />
τDκ 2<br />
T = Triplettfraktion τT = Triplettzeit<br />
N = Anzahl der Partikel im Fokus τ = Korrelationszeit<br />
τD = Diffusionszeit κ = Strukturparameter<br />
bestimmt. Um den Sättigungsgrad des IQ488-CaM-Komplexes für CaM-Konzentrationen<br />
zwischen 1 nM und 5,6 µM und den des IQ488-GST-CaM-Komplexes für GST-CaM-Kon-<br />
zentrationen zwischen 0,7 nM und 3,7 µM zu bestimmen, wurden die Autokorrelations-<br />
funktionen mit einem Zwei-Komponenten-Modell angepasst:<br />
(9)<br />
(10)<br />
(11)<br />
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