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4 Diskussion Spannungsrampen. Da bei letztgenannter Methode der absolute Strom betrachtet wird, fließt der für den Sec61-Komplex charakteristische Leckstrom hier mit in die Auswer- tung ein (siehe 2.3.13). Die Daten deuten darauf hin, dass die Selektivität des Sec61- Komplexes durch den Leckstrom maßgeblich herabgesetzt wird. Weitere Untersuchungen mit asymmetrischen MgCl2-Lösungen haben ein Verhältnis der Permeabilitätskoeffizienten von P Cl −/P Mg 2+=6,5 für die RM-Probe aus Strom-Span- nungsrampen ergeben. Ein Vergleich mit dem entsprechenden Wert für CaCl2 (P Cl −/ P Ca 2+= 6,8) zeigt, dass der Kanal nicht zwischen den bivalenten Kationen diskriminieren kann. Die Selektivität eines weiten Ionenkanals wird maßgeblich durch elektrostatische Wech- selwirkungen der permeierenden Ionen mit polaren oder geladenen Aminosäureresten in der Porenregion bestimmt (Aguilella-Arzo et al., 2007). Dabei wird die Permeabilität für Kationen durch negative Ladungen in der Pore erhöht und durch positive Ladungen verringert. Versuche mit Mutanten von bakteriellen β-Barrel Porinen mit bekannter 3D- Struktur haben gezeigt, dass sich die Selektivität durch einen Austausch der geladenen Aminosäuren in der Porenregion in der zu erwartenden Weise verändern lässt (Phale et al., 2001; Miedema et al., 2004). Die Nettopermeation von Anionen und Kationen durch einen weiten Kanal wird letztlich durch die Anzahl der energetisch günstigen Tra- jektorien auf denen Anionen und Kationen eine Pore durchqueren können sowie deren Besetzungshäufigkeit festgelegt (Schirmer und Phale, 1999; Im und Roux, 2002a). Es ergibt sich die Frage, wie das für den Durchmesser der Sec61-Pore relativ hohe Um- kehrpotenzial in asymmetrischen CaCl2- oder MgCl2-Elektrolytlösungen im Vergleich zu KCl-Lösungen verursacht wird. Nach Eisenman und Horn (1983) wird die Selektivität eines single-file-Ionenkanals von dem Energieaufwand für die Entfernung der Hydrathülle eines beteiligten Ions und dem Energiegewinn aus dessen elektrostatischer Interaktion mit geladenen Aminosäureresten in der Pore bestimmt. Die freiwerdenden Koordina- tionsstellen des Ions werden dabei durch die geladenen Gruppen in der Pore ersetzt. Computergestützte Simulationen haben gezeigt, dass K + - und Cl − -Ionen auch während der Permeation durch die Restriktionszone eines weiten Kanals wie OmpF einen Teil der koordinierten Wassermoleküle verlieren (Im und Roux, 2002b). Auch für den Sec61- Kanal wäre demnach eine teilweise Dehydrierung der permeierenden Ionen denkbar. Die Hydrationsenergie für Ca 2+ - und Mg 2+ -Ionen ist um ein Mehrfaches höher als für K + - und Cl − -Ionen (Hille, 2001, Seite 329), so dass die Permeation von Ca 2+ und Mg 2+ durch den Sec61-Kanal energetisch deutlich ungünstiger ist als die Permeation von K + - und Cl − . Die beobachteten Selektivitäten lassen sich gut über die Energiedifferenzen für die Dehydrierung der beteiligten Ionen erklären. Eine symmetrische Zugabe von CaCl2 bis zu Konzentrationen von 90 mM zu asymmetri- 86
4.4 Umkehrpotenzial und Selektivität schen KCl-Elektrolytlösungen verändert das Umkehrpotenzial des Kanals nur minimal. Dieses Ergebnis zeigt, dass die unterschiedlichen Umkehrpotenziale und Selektivitäten des Sec61-Kanals in KCl- oder CaCl2-Puffer nicht auf einer Ca 2+ -induzierten Konfor- mationsveränderung in einen Offenzustand mit generell höherer Kationenselektivität beruht. Außerdem kann davon ausgegangen werden, dass nicht die Einbringung zusätz- licher positiver Ladungen in Form von Ca 2+ oder Mg 2+ die Permeabilitäten des Kanals bestimmt, sondern die kanalintrinsische Ladungsverteilung ausschlaggebend für die Se- lektivitäten für monovalente oder bivalente Kationen ist. Ob überdies auch ein in der Porenregion befindliches Translokationssubstrat bei Messungen mit Sec61-Kanälen aus RM-Präparationen einen Einfluss auf das Umkehrpotenzial hat, kann im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Über die physiologische Bedeutung der ermittelten Selektivitäten kann nur spekuliert werden. Die Konzentration freier Calciumionen im Cytosol der Zelle reguliert eine Viel- zahl biochemischer und physiologischer Prozesse. Das ER-Lumen dient dabei als intra- zellulärer Calciumspeicher, aus dem Ca 2+ -Ionen strikt reguliert freigesetzt werden (siehe 1.3). Über der ER-Membran liegt im Ruhezustand ein Calcium-Gradient von 3-4 Grö- ßenordnungen (Yu und Hinkle, 2000; Smith et al., 2001; Alvarez und Montero, 2002), für dessen Aufrechterhaltung Energie in Form von ATP bereitgestellt werden muss. Die Er- gebnisse der Experimente unter asymmetrischen CaCl2-Bedingungen zeigen, dass Ca 2+ - Ionen die Sec61-Pore deutlich schlechter permeieren können als Cl − -Ionen. Nach Alcaraz et al. (2004) nimmt die Selektivität einer weiten Pore mit abnehmender Elektrolytkon- zentration zu, weil Ladungen in der Porenregion bei niedriger Ionenstärke der Pufferlö- sung weniger stark abgeschirmt und die effektiven Ladungen in der Pore dadurch erhöht werden. Untersuchungen an chloroplasitdären PRAT-Proteinen haben diese Beobach- tung bestätigt (Götze, 2009). Für die in vivo vorliegenden Konzentrationsbedingungen von [Ca 2+ ]cyt ≈50 nM-100 nM (Yu und Hinkle, 2000; Smith et al., 2001) und [Ca 2+ ]lum ≈500 µM (Yu und Hinkle, 2000; Alvarez und Montero, 2002) wäre demnach eine deutlich höhere Selektivität des Sec61-Kanals gegenüber Calciumionen zu erwarten, als in den elektrophysiologischen Experimenten beobachtet wurde. Es ist denkbar, dass die Selektivitätseigenschaften zur Limitierung des passiven Calcium-Ausstromes aus dem ER-Lumen beitragen und somit sowohl für die Regulation der Ca 2+ -Freisetzung aus dem ER-Lumen als auch für den Energiehaushalt der Zelle von Bedeutung sind. Da die tatsächlichen Ladungs- und Ionenverhältnisse an der ER-Membran aufgrund der Vielzahl der vorhandenen Ionen und weiterer geladener Moleküle überaus komplex sind, wird hier auf eine abschließende Aussage über die physiologische Bedeutung der Selektivität des Sec61-Kanals in vivo verzichtet. 87
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Zur Regulation der Proteintransloka
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Inhaltsverzeichnis 2.2.7 Fluoreszen
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1 Einleitung Eine der wichtigsten F
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1.2 Die Protein-Translokase des End
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1.3 Das Endoplasmatische Retikulum
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1.4 Calmodulin konnten zeigen, dass
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1.4 Calmodulin mit der N-terminalen
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wie Lanthan? 1.5 Zielsetzung der vo
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2.1 Verwendete Proben Abbildung 2.1
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2.1 Verwendete Proben pIVEX2.3MCS),
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2.2 Biochemische Methoden wurden di
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2.2 Biochemische Methoden Peptid in
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2.3 Elektrophysiologische und bioph
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2.3.5 Liquid junction Potenziale 2.
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Seite 47 und 48: 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung
Seite 49 und 50: 3.1 Charakterisierung des Sec61-Kom
Seite 77 und 78: 3.2 Charakterisierung der rauen Mik
Seite 83 und 84: 4 Diskussion 4.1 Fusion der Proben
Seite 85 und 86: 4.2 Schaltverhalten und Leitwerte d
Seite 91: 4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
Seite 95 und 96: 4.6 Interaktion mit Lanthan- und Al
Seite 97 und 98: 4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
Seite 103 und 104: 4.9 Veränderungen durch Ribosomen
Seite 105 und 106: 4.10 Eigenschaften der rauen Mikros
Seite 107 und 108: • Ribosomen führen in nanomolare
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