b a c - repOSitorium - Universität Osnabrück

2 Material und Methoden
ein voll ausgebildeter Bilayer mit deutlich zurückgegangenem Annulus (Abbildung 2.6
c) hergestellt werden (Müller et al., 1963). Dieser blieb über mehrere Stunden stabil.
a b
c
Abbildung 2.6: Herstellung des planaren Bilayers
2.3.8 Fusion der Probenliposomen mit dem planaren Bilayer
Für die erfolgreiche Fusion von Ionenkanälen in den planaren Bilayer sind sowohl geöff-
nete Kanäle in den Membranen der Liposomen (siehe 2.2.10), als auch ein osmotischer
Gradient über dem Bilayer essenziell (Cohen et al., 1980, Niles und Cohen, 1987). Blobel
und Dobberstein (1975), Simon und Blobel (1991) sowie Wirth et al. (2003) beobachte-
ten, dass der Sec61-Komplex bei höheren Salzkonzentrationen in geschlossenem Zustand
vorliegt bzw. nicht in den planaren Bilayer inkorporiert. Deshalb wurde für die Fusionen
ein Verhältnis von 100 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 cis zu 10 mM KCl, 10 mM
Mops/Tris pH 7 trans gewählt (Wirth, 2003). Es hat sich herausgestellt, dass eine Erhö-
hung des osmotischen Gradienten über der Membran (250 mM KCl, 10 mM Mops/Tris
pH 7 cis zu 10 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 trans) entgegen früheren Beobachtun-
gen die Fusionsrate positiv beeinflusst hat. Um Fusionen zusätzlich zu fördern wurden
15 µl 2 M CaCl2 in die Cis-Kammer pipettiert. Die Ca 2+ -Ionen sollen nach Cohen et
al. (1980) und Niles und Cohen (1987) eine Adhäsion der polaren Kopfgruppen der
Liposomenlipide an den Bilayer erleichtern.
Weiterhin förderlich für die Fusionsraten hat sich das Beschallen der Proben mit Ultra-
schall gezeigt. Da der Durchmesser des Bilayers quadratisch in die Fusionswahrschein-
lichkeit eingeht hat sich auch eine Vergrößerung des Loches im Septum als hilfreich
erwiesen, was allerdings eine verminderte Stabilität der Membran zur Folge hatte.
1-2 µl Probe wurden mit einer um 45° gebogenen 10 µl Hamilton-Spritze in der Cis-
Halbkammer über (wenn Dichte der Probe höher war als Dichte des Elektrolytes) oder
unter (wenn Dichte der Probe geringer war als Dichte des Elektrolytes) dem Bilayer ab-
gesetzt, so dass die Liposomen in unmittelbare Nähe der Membranoberfläche gelangten.
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