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2 Material und Methoden Abbildung 2.5: Versuchsaufbau und Ersatzschaltbild des Bilayersystems a: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit inkorporiertem Kanal, Elektrolytlösungen, Elektroden, Spannungsquelle (V) und Amperemeter (A). b: Ersatzschaltbild zu a. Der Kanal ist durch den Widerstand RM, Elektroden und Elektrolytlösungen durch den Widerstand REl und die Membrankapazität durch den Kondensator CM mit Spannungsquelle (U) und Amperemeter (I) dargestellt. verbunden, die Elektrode der Cis-Kammer liegt an der Masse der Headstage und dient somit als Referenzelektrode. Bei der hier beschriebenen Anordnung wird ein Fluss von Kationen von trans nach cis bzw. ein Fluss von Anionen in die Gegenrichtung als posi- tiver Strom aufgezeichnet. Die softwaregestützte Datenaufnahme bei konstanten Klemmspannungen erfolgte mit dem Programm Axoscope 9.0 (Axon Instruments) bei einer Samplingfrequenz von 5- 10 kHz. Für das kontinuierliche Abtasten eines Spannungsbereiches (Strom-Spannungs- rampe) wurde das Programm Clampex (Dr. Alexander Merle) bei einer Samplingrate von 2 kHz verwendet. 28
2.3.5 Liquid junction Potenziale 2.3 Elektrophysiologische und biophysikalische Methoden An Grenzflächen zwischen Lösungen mit deutlich unterschiedlichen Konzentrationen zweier Ionensorten kann es zum Auftreten von Diffusionspotenzialen kommen, wenn eine der Ionensorten eine erhöhte Mobilität aufweist und demzufolge schneller über den Konzentrationsgradienten an der Grenzfläche diffundiert (Liquid junction Potenzial). Im beschriebenen Versuchsaufbau (2.3.4) kann dieser Effekt an der Grenzfläche zwischen der Elektrolytlösung in der Messkammer und der KCl-Agaroselösung der Elektroden auftreten. In Abhängigkeit vom verwendeten Elektrolyten kann es, besonders bei der Bestimmung von Umkehrpotenzialen nach 2.3.13 zu einer Verfälschung der Ergebnisse von -5 bis +12 mV kommen (Neher, 1992). Die bei der Verwendung von KCl-Lösungen auftretenden Liquid junction Potenziale betragen ca. 1 mV und sind vernachlässigbar. Für Experimente mit asymmetrischen CaCl2- und MgCl2-Puffern (siehe 3.1.5) wurde das Liquid junction Potenzial mit den Programm Clampex (Axon Instuments) nach Barry und Lynch (1991) mit 3,8 mV bzw. 4,1 mV berechnet und die Ergebnisse entsprechend korrigiert. Bei Messungen mit CaCl2- und MgCl2-Puffern unter symmetrischen Bedingungen wurde das Nullstrompotenzial (zero current Potenzial) nach erfolgter Perfusion auf 0 mV festgesetzt. 2.3.6 Aufbereiten des Bilayerlipides Das Lipid (L-α-PC Type IV-S, Sigma) wurde mit einer Konzentration von 100 mg/ml in Methanol-Chloroform (Verhältnis 1:1) gelöst und bei -20°C gelagert. Zur Herstel- lung des Bilayers wurden 55 µl der Lösung entnommen und die Lösungsmittel für ca. 30 Minuten mit Hilfe einer Membranvakuumpumpe (Vakuumbrand, MZ2C) evaporiert. Anschließend wurde das Lipid in 100 µl n-Decan (Sigma) aufgenommen und je nach Viskosität (optische Kontrolle) nachverdünnt, bis die Proben mit dem Bilayer fusioniert werden konnten. 2.3.7 Herstellung des Bilayers Zur Herstellung des Bilayers nach der painting technique wurde mit einer um 90° gebo- genen 50 µl Hamilton-Spritze ein Tropfen Lipid auf das Loch im Septum (siehe 2.3.2) appliziert (Abbildung 2.6 a). Danach konnte durch wiederholtes Absenken des Flüssig- keitsspiegels in der Trans-Kammer die Lipidmenge auf dem Loch soweit reduziert werden, dass sich eine unilamellare Lipiddoppelschicht ausbildete (Abbildung 2.6 b). Der Bilayer erschien hier als durchsichtige Fläche, umgeben von einem ringförmigen Annu- lus. Durch weitergehendes Reduzieren der aufgetragenen Lipidmenge konnte schließlich 29
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4.4 Umkehrpotenzial und Selektivit
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4.8 Regulation des Sec61-Komplexes
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4.9 Veränderungen durch Ribosomen
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• Ribosomen führen in nanomolare
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