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3 Ergebnisse 48 Abbildung 3.5: Strom-Spannungsdiagramme für Messungen mit rauen Mikrosomen unter asymmetrischen Elektrolytbedingungen a: Strom-Spannungskennlinie für Haupt- (schwarz) und Unterleitwert (rot) (250 mM KCl cis, 20 mM KCl trans, n=1468 Schaltereignisse). b: Strom-Spannungskennlinie für Hauptund Unterleitwert (10,7 mM CaCl2 cis, 184 mM CaCl2 trans, n=2073 Schaltereignisse). c: Strom-Spannungsdiagramm aus Spannungsrampen eines Einzelkanals für Elektrolytbedingungen wie in a. d: Strom-Spannungsdiagramm eines Einzelkanals für Elektrolytbedingungen wie in b. e: Strom-Spannungsdiagramm eines Einzelkanals für Elektrolytbedingungen wie in a vor (schwarz) und nach (rot) Zugabe von 90 mM CaCl2 cis/trans. f: Strom- Spannungsdiagramm eines Einzelkanals (10,4 mM MgCl2 cis, 176 mM MgCl2 trans). Alle Puffer mit 10 mM Mops/Tris pH 7.
3.1 Charakterisierung des Sec61-Komplexes aus Canis familiaris schaltereignisse verursachten Stromänderungen ergibt Mittelwerte von -8,7 mV für den Hauptleitwert und -4,7 mV für den Unterleitwert des Kanals aus RM-Präparationen in KCl-Lösungen (250 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 cis, 20 mM KCl, 10 mM Mops/Tris pH 7 trans, Abbildung 3.5 a). Daraus ergeben sich Permeabilitätsverhält- nisse von Chlorid- zu Kaliumionen von P Cl −/P K + = 1,5 und P Cl −/P K + =1,24. Unter Verwendung von CaCl2-Puffern (10,7 mM CaCl2, 10 mM Mops/Tris pH 7 cis, 184 mM CaCl2, 10 mM Mops/Tris pH 7 trans, Abbildung 3.5 b) liegen die Umkehrpotenzia- le nach Korrektur des Liquid junction Potenziales (2.3.5; Barry und Lynch, 1991) bei 42,1 mV und 38,6 mV für Haupt- und Unterleitwert. Diese Werte entsprechen Permea- bilitätsverhältnissen von P Cl −/P Ca 2+ = 12,4 und P Cl −/P Ca 2+ =10,0. Wird das Umkehrpotenzial über Spannungsrampen aus den absoluten Strömen be- stimmt, so kann ebenfalls eine Abhängigkeit der Werte vom Offenzustand des Kanals beobachtet werden (Abbildung 3.5 c,d,f), die für alle untersuchten Präparationen des Sec61-Komplexes charakteristisch ist. Dieses Ergebnis ist mit einer früheren elektrophy- siologischen Untersuchung am Translokon konsistent (Erdmann, 2004). Die mittleren Umkehrpotenziale und entsprechenden Permeabilitätsverhältnisse für raue Mikrosomen und den aufgereinigten Sec61-Komplex sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. Tabelle 3.3: Umkehrpotenziale und Selektivitäten der verschiedenen Proben des Sec61- Komplexes Auswertung der Daten aus Strom-Spannungsrampen. n = Anzahl vermessener Bilayer. Probe Elektrolytbedingungen Urev [mV] ∗ PA/PK n RM 250 mM KCl zu 20 mM KCl -8,5 ± 7,8 1,5 10 Sec61-Komplex 250 mM KCl zu 20 mM KCl -10,7 ± 10,1 1,6 5 RM 184 mM CaCl2 zu 10,7 mM CaCl2 -32,1 ± 9,3 6,8 8 Sec61-Komplex 184 mM CaCl2 zu 10,7 mM CaCl2 -36,4 ± 5 8,7 5 RM 176 mM MgCl2 zu 10,4 mM MgCl2 -31,4 ± 5,8 6,5 5 Eine Ermittelung des Umkehrpotenziales nach dieser Methode hat im Fall des Sec61- Kanals den Nachteil, dass die Leckleitfähigkeiten der Pore (3.1.2) mit in die erhaltenen Werte einfließen. Umkehrpotenziale und Permeabilitätsverhältnisse sind im Vergleich zur Auswertung aus Einzelkanalschaltereignissen reduziert. Der Kanal des Translokons zeigt in allen untersuchten Proben unter asymmetrischen CaCl2- und MgCl2-Elektrolytbedingungen eine deutlich erhöhte Anionenselektivität im Vergleich zu Experimenten mit asymmetrischen KCl-Lösungen. Es sollte untersucht werden, ob die im Vergleich geringere Kationenpermeation auf die bivalenten Ionen be- ∗ nach Korrektur des Liquid junction Potenziales bei Verwendung von CaCl2- und MgCl2-Elektrolyten 49
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