Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung Acidovorax ...

MATERIAL UND METHODEN
2. Blockierung:
200 µl Waschpuffer (PBS) mit 1 % Trockenmilch (TM) wurden in jede
Vertiefung pipettiert. Die Platten wurden anschließend für eine Stunde bei
37 °C inkubiert. Für den folgenden Schritt wurden die Platten nicht
gewaschen, sondern nur Blockierungspuffer entfernt.
3. Pflanzensaft beziehungsweise Probe:
Die zu untersuchenden Pflanzenblätter oder gewachsenen Bakterienkolonien
wurden 1:10 oder 1:20 (je nach Materialmenge) in Extraktionspuffer
homogenisiert und entweder direkt verwendet oder eingefroren. 100 µl der
Probe (frisch oder aufgetaut) wurde in je eine Vertiefung gefüllt, wobei jede
Probe als Doppelbestimmung aufgetragen worden ist. Die Inkubation
erfolgte bei 4 °C über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurden die Platten
viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.
4. monoklonaler Antikörper:
100 µl des 1:2000 in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnten
monoklonalen Antikörpers 7C10ESB10 wurde in jede Vertiefung pipettiert.
Die Platten wurden anschließend bei 37 °C inkubiert. Nach zwei Stunden
wurden die Platten viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.
5. Konjugat (Ziege Anti Maus-Anti-Körper (ZAMAK):
Für diesen Schritt wurde das verwendete Konjugat im Verhältnis von 1:2000
in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnt. Die Inkubation von 100 µl
pro Vertiefung wurde für eine Stunde bei 37 °C durchgeführt. Danach wurden
die Platten viermal mit Waschpuffer gewaschen.
6. Substrat:
200 µl 1 mg p-Nitrophenyldihydrogenphosphat je 1 ml Substratpuffer wurde
pro Vertiefung aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde bei
Raumtemperatur unter Lichtausschluss. Am ELISA-Reader wurden
Messungen bei 405 nm und 490 nm Wellenlänge durchgeführt.
Nicht-inokulierte, symptomlose Blätter wurden als Negativkontrolle und inokulierte,
Symptom tragende Blätter als Positivkontrolle 1:50 in Extraktionspuffer verdünnt
und in die erste Spalte (gesund) und in die letzte verwendete Spalte (infiziert) auf der
Platte aufgetragen, um ein Verschleppen während des Auftragens beziehungsweise
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