(Rättsakter vilkas publicering är obligatorisk) KOMMISSIONENS ...

21.8.2001 L 225/187
Europeiska gemenskapernas officiella tidning
SV
Äggen överförs till testkärlen med hjälp av glasrör (innerdiameter minst 4 mm) som är försedda med en mjuk sugboll.
Vid överföring av äggen bör den medföljande vattenmängden vara så liten som möjligt. Äggen är tyngre än vatten och
sjunker ut ur röret. Det är viktigt att se till att ägg (och yngel) inte kommer i kontakt med luft. Ett eller flera prover av
satsen eller satserna undersöks i mikroskop för att kontrollera att det inte förekommer irregulariteter i de första utvecklingsstadierna.
Det är inte tillåtet att desinfektera äggen.
Mortaliteten för äggen är högst under de första 24 timmarna efter befruktningen. Under denna period är det vanligt
med en mortalitet på 5-40 %. Äggen kan degenerera till följd av misslyckad befruktning eller utvecklingsstörningar.
Äggens kvalitet verkar bero på fiskhonan, eftersom vissa honor genomgående producerar ägg av god kvalitet medan
andra aldrig gör det. Även utvecklingshastigheten och kläckningshastigheten varierar mellan olika satser. Framgångsrikt
befruktade ägg och säckyngel överlever till stor del, i regel över 90 %. Vid 25 °C kläcks äggen 3-5 dagar efter befruktningen
och gulesäcken har absorberats cirka 13 dagar efter befruktningen.
Den embryonala utvecklingen har definierats väl av Hisaoka och Battle (2). Äggen och nykläckta yngel är genomskinliga
och därför kan man följa med fiskens utveckling och observera eventuella missbildningar. Cirka fyra timmar efter romläggningen
kan man se skillnaden mellan obefruktade ägg och befruktade ägg (3). För denna undersökning placeras ägg
och yngel i små testkärl och granskas under mikroskop.
De testbetingelser som bör användas för de tidiga levnadsstaderna uppräknas i tillägg 2. Optimala värden för pH och
spädvattnets hårdhet är 7,8 respektive 250 mg CaCO 3/l.
BERÄKNINGAR OCH STATISTIK
En tvåstegsmetod rekommenderas. Först görs en statistisk analys av data gällande mortalitet, onormal utveckling och
kläckningstid. Därefter görs en statistisk utvärdering av kroppslängden hos de exemplar som behandlats i koncentrationer
vid vilka inga skadliga verkningar på någon av de nämnda parametrarna har detekterats. Denna metod rekommenderas
eftersom ett toxiskt ämne selektivt kan döda mindre fisk, förlänga kläckningstiden och framkalla grova missbildningar,
vilket leder till missvisande längdmätningsresultat. Dessutom mäts ungefär samma antal fiskar per behandling,
vilket säkerställer de statistiska resultatens giltighet.
BESTÄMNING AV LC 50 OCH EC 50
Procentandelen överlevande ägg och yngel beräknas och korrigeras för mortaliteten i kontrollgrupperna, enligt Abbotts
formel (4):
där
P = korrigerad procentandel överlevande,
P = 100 ¯
C ¯ P0
C
× 100
P¡ = procentandel överlevande som observerats i testkoncentrationen,
C = procentandelen överlevande i kontrollgruppen.
I mån av möjlighet bestäms LC 50 vid testets slut med en lämplig metod.
Anvisningar för hur man kan få in morfologiska abnormaliteter i EC 50 -statistiken har publicerats av Stephan (5).
UPPSKATTNING AV LOEC OCH NOEC
Ett av syftena med testet på ägg och säckyngel är att jämföra koncentrationer över noll med kontrollgruppens koncentrationer,
dvs. att bestämma värdet på LOEC. Därför bör förfaranden med multipeljämförelse användas (6), (7), (8), (9).
(10).
REFERENSER
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature
Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121-173.
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio
(Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.