"Chronopsychobiologischen Regulationsdiagnostik" (CRD)

66 TIERE, MATERIAL UND METHODE
Vorbereitung zur Salivacortisol-Diagnostik auch in der Veterinärmedizin eingesetzt
werden.
Das ELISA-Kit enthielt folgende Komponenten: Mikrotiterplatte, Enzymkonjugat,
Standardlösungen A-G, Kontrollen 1 und 2, TMB-Substratlösung, TMB-Stopplösung,
Waschpufferkonzentrat und Haftklebefolie.
Der Cortisol ELISA ® ermöglicht einen Messbereich für Speichel von 0,030
(niedrigster Standardwert) – 4 (höchster Standardwert) µg/dl Cortisol, das bedeutet
30 – 4000 ng/dl Cortisol. Die Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) für Cortisol
liegt bei 5 ng/dl, die Bestimmungsgrenze (funktionelle Sensitivität) bei 30 ng/dl. Die
Intra-Assay Variation beträgt 7,3 - 3,1 %, die Inter-Assay Variation 8,8 – 6,4 %.
Laut Herstellerangaben handelt es sich um einen kompetitiven Enzymimmunoassay
(ELISA): Die unbekannte Menge an Antigen (Speichelcortisol) in der Probe
konkurriert mit der bekannten, hinzugegebenen Menge an enzymmarkierten Antigen
(enzymmarkiertes Cortisol) um die Bindungsstelle des an die Wells der
Mikrotiterstreifen gebundenen Antikörpers. Nicht gebundenes enzymmarkiertes
Antigen (Cortisol) wird nach der Inkubation durch Waschen entfernt. Somit ist die
Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion umgekehrt proportional zur
Speichelcortisol-Konzentration in den Proben.
Es ist darauf zu achten, dass der pH-Wert der Probenlösung (Speichel) nicht unter
pH 4 absinkt. Ein sehr niedriger pH-Wert im Speichel führt durch
Enzymbehinderungen im ELISA zur Ermittlung eines zu hohen Cortisolwertes
(kompetitiver ELISA).
Als Qualitätskontrolle wurde auf jeder Mikrotiterplatte eine komplette Standardreihe
sowie die Kontrolle 1 (148 ng/dl Cortisol) für den unteren Analysebereich
mitbestimmt.
Um den ELISA durchzuführen, wurde eine Multipipette (Transferpette ® 8, 20-200 µl,
Firma Brand) mit Reagent Reservoirs (Electrapette ® ), sowie eine Eppendorf
Reference ® (50 und 100 µl) Pipette mit gelben Pipettenspitzen verwendet. Je 50 µl
der Standards, Kontrollen und Proben wurden in die entsprechenden Wells der
Mikrotiterplatte pipettiert. Die Speichelproben mussten nicht verdünnt werden und
konnten direkt aus dem Zentrifugengefäß der Salivette ® pipettiert werden. Zügig