"Chronopsychobiologischen Regulationsdiagnostik" (CRD)

TIERE, MATERIAL UND METHODE 67
wurden je Well 100 µl Enzymkonjugat hinzugefügt. Die mit Haftklebefolie abgedeckte
Mikrotiterplatte musste dann zwei Stunden bei Raumtemperatur (18-25 °C) auf
einem Orbitalschüttler (Orbital Shaker S03 Stuart Scientific, maximal 250 U/min)
inkubiert werden. In der Zwischenzeit wurde der Waschpuffer hergestellt: Das
Waschpufferkonzentrat musste 1:10 mit bidestilliertem Wasser verdünnt werden, um
100 ml gebrauchsfertige Waschpufferlösung herzustellen. Nach zwei Stunden konnte
die Folie entfernt und die Inkubationslösung verworfen werden. Die Mikrotiterplatte
wurde viermal mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer gewaschen und auf
Papiertüchern wurde die restliche Flüssigkeit ausgeklopft. Danach wurden je 100 µl
TMB Substratlösung in jedes Well pipettiert. Nun musste die Platte bei
Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler weitere 30 Minuten inkubiert werden. Dann
wurde die Substratreaktion durch Zugabe von TMB Stopplösung (100 µl) gestoppt.
Bei erfolgreichem Verlauf erfolgte ein Farbumschlag von blau nach gelb.
Mit einem MRX Reader Photometer wurde zum Schluss bei 450 nm die optische
Dichte gemessen. Weil es sich um einen kompetitiven ELISA handelte, hatte die
Standardkurve einen sigmoiden Verlauf. Um bessere Ergebnisse zu erzielen wurde
eine Probid Transformation durchgeführt, das bedeutet, die optische
Dichte / Extinktion wurde in %-Bindung des Antikörpers umgerechnet.
3.5.2 Einteilung in Cortisolverlaufstypen
Es wurde der jeweilige Trend der einzelnen Cortisolverlaufskurven bestimmt. Durch
den Vergleich von Ruhewert (Probe 0) mit dem letzten Cortisolwert nach dem Test
(Probe 7) wurde ermittelt, ob die Cortisolkurve ansteigt, gleich bleibt, oder abfällt.
Infolgedessen wurden drei Cortisolverlaufstypen bestimmt (HARDER 2000):
Ein Cortisolverlauf mit
ansteigender Tendenz (1)
gleich bleibender Tendenz (0)
abfallender Tendenz (-1).
In der folgenden Abbildung 22 werden die einzelnen Verlaufstypen anhand von
Beispielen einzelner Pferde graphisch dargestellt. Die Kurve in Lila beschreibt jeweils
den Cortisolverlauf. Die rote Linie gibt den Trend wieder.