华 南 农 业 大 学 农 学 院 第 三 届 综 述 大 赛 获 奖 作 品 论 文 集一 等 奖 作 品诱 变 技 术 , 并 且 可 以 引 起 基 因 表 达 的 变 化 , 通 过 时 间 的 推 移 和 植 物 不 断 的 繁 殖 进 化 ,DNA甲 基 化 的 这 种 改 变 也 可 导 致 遗 传 变 异 , 最 终 引 起 植 物 的 变 异 和 进 化 , 这 对 于 植 物 育 种 和改 良 具 有 重 要 的 意 义 。所 有 以 上 的 研 究 说 明 , 非 生 物 胁 迫 可 造 成 全 基 因 组 和 特 异 位 点 胞 嘧 啶 甲 基 化 的 升 高[35]或 降 低 , 而 这 种 甲 基 化 的 改 变 可 通 过 调 控 基 因 表 达 使 植 物 能 够 更 好 的 适 应 外 界 环 境 的[36, 37]变 化 。 除 此 之 外 , 生 物 体 都 有 共 同 的 抵 御 逆 境 胁 迫 的 诸 如 活 性 氧 种 (ROS) 清 除 系 统 、ABA [38] [39] [39]等 激 素 的 产 生 、 渗 透 调 节 物 质 积 累 、 形 态 反 应 等 生 物 学 途 径 , 而 与 胁 迫 相 关[40]的 一 些 基 因 大 多 数 为 转 录 因 子 , 在 某 种 胁 迫 条 件 下 , 如 果 调 控 某 个 生 理 生 化 途 径 的 基因 的 CG 富 集 位 点 发 生 甲 基 化 的 改 变 , 那 么 就 可 以 推 测 出 在 其 他 逆 境 条 件 下 的 这 个 途 径也 有 可 能 发 生 DNA 的 甲 基 化 变 化 。 例 如 除 草 剂 、 盐 和 低 温 都 可 诱 导 离 体 烟 草 叶 片 NtGPDL[26]基 因 去 甲 基 化 与 基 因 表 达 上 调 效 应 , 而 铝 离 子 、 除 草 剂 和 低 温 都 可 使 植 物 产 生 大 量 活性 氧 成 分 。 和 经 典 遗 传 学 中 基 因 突 变 不 同 ,DNA 甲 基 化 可 随 着 环 境 的 变 化 而 发 生 改 变 ,[41]这 种 变 化 在 一 定 时 间 范 围 内 是 稳 定 的 , 并 且 它 能 够 在 个 体 中 表 现 出 不 同 的 遗 传 力 。DNA甲 基 化 的 这 个 特 征 使 其 成 为 环 境 改 变 响 应 的 一 个 潜 在 地 重 要 分 子 过 程 , 这 对 于 植 物 在 逆境 胁 迫 中 的 育 种 运 用 上 具 有 重 要 的 指 导 意 义 。 另 一 方 面 , 利 用 DNA 甲 基 化 多 态 性 所 获 得的 遗 传 距 离 并 不 能 完 全 反 映 亲 缘 关 系 、 地 理 分 布 或 表 型 变 异 , 因 此 , 对 表 观 遗 传 距 离 与[3]经 典 遗 传 距 离 的 理 解 应 区 别 对 待 。3 DNA 甲 基 化 在 植 物 抗 旱 性 育 种 中 的 潜 在 应 用3.1 植 物 DNA 甲 基 化 多 态 性 和 可 遗 传 性 为 抗 旱 性 育 种 提 供 了 可 能前 面 已 经 介 绍 了 植 物 体 细 胞 能 够 感 受 环 境 变 化 或 胁 迫 , 并 诱 导 植 物 基 因 组 产 生 DNA[35]甲 基 化 多 态 性 , 从 而 产 生 新 的 表 型 变 异 。 同 时 , 生 殖 细 胞 来 自 于 发 育 后 期 的 体 细 胞 组 织 ,因 此 环 境 改 变 或 胁 迫 引 起 的 甲 基 化 等 表 观 遗 传 变 异 可 通 过 减 数 分 裂 遗 传 给 后 代 , 这 在 拟[42] [43] [44]南 芥 、 水 稻 、 高 粱 都 得 到 了 证 实 。 说 明 DNA 甲 基 化 多 态 性 可 能 是 一 种 重 要 的 作[45]物 改 良 手 段 , 利 用 甲 基 化 变 异 , 有 可 能 实 现 对 遗 传 基 础 狭 窄 的 作 物 的 改 良 。DNA 甲 基[46] [43]化 多 态 性 可 产 生 表 型 的 变 异 , 这 在 一 些 重 要 农 艺 性 状 如 降 低 顶 端 优 势 、 株 型 减 小 、[46] [47] [48]叶 片 大 小 和 形 状 , 育 性 降 低 、 花 期 改 变 和 杂 种 优 势 已 有 直 接 的 表 现 。 因 此 , 利 用甲 基 化 多 态 性 将 是 植 物 抗 旱 性 育 种 选 育 的 有 利 途 径 。 除 此 之 外 , 植 物 通 过 各 种 生 理 生 化途 径 来 调 节 各 种 胁 迫 响 应 物 质 以 适 应 逆 境 , 而 调 控 不 同 基 因 的 表 达 和 相 应 蛋 白 的 功 能 的能 力 是 植 物 抗 性 表 现 的 基 础 , 这 些 与 抗 旱 性 等 逆 境 胁 迫 相 关 元 素 大 多 都 是 有 转 录 因 子 调控 的 。 转 录 因 子 主 要 发 生 在 启 动 子 区 ,DNA 甲 基 化 可 抑 制 转 录 因 子 结 合 到 靶 基 因 部 位 ,[49]导 致 转 录 抑 制 产 生 基 因 沉 默 现 象 。 在 胁 迫 环 境 下 特 定 基 因 位 点 DNA 甲 基 化 和 去 甲 基 化将 会 造 成 植 物 特 定 基 因 表 达 的 差 异 , 暗 示 了 甲 基 化 等 表 观 遗 传 变 异 在 抗 旱 性 育 种 中 的 潜在 应 用 价 值 。 通 过 DNA 甲 基 化 / 去 甲 基 化 抑 制 剂 处 理 创 造 突 变 材 料 , 不 仅 可 以 作 为 植 物抗 旱 性 帅 选 平 台 , 而 且 也 可 以 对 抗 旱 性 植 物 材 料 进 行 深 入 的 研 究 , 关 联 抗 旱 性 与 甲 基 化机 制 。39
华 南 农 业 大 学 农 学 院 第 三 届 综 述 大 赛 获 奖 作 品 论 文 集一 等 奖 作 品3.2 DNA 甲 基 化 检 测 方 法 为 抗 植 物 旱 性 育 种 创 造 了 条 件一 般 而 言 , 可 以 分 辨 出 甲 基 化 修 饰 的 方 法 主 要 有 以 下 几 种 :a、 甲 基 化 敏 感 扩 增 多 态性 (MSAP);b、 亚 硫 酸 氢 盐 的 修 饰 ;c、 特 异 性 识 别 甲 基 化 修 饰 DNA 的 抗 体 或 蛋 白 ;d、[50]质 谱 或 色 谱 等 精 密 检 测 手 段 。 目 前 , 基 因 的 甲 基 化 研 究 主 要 结 合 亚 硫 酸 氢 钠 处 理 和 PCR技 术 。 广 泛 应 用 的 技 术 是 Herman 建 立 的 甲 基 化 特 异 性 的 PCR 技 术 (MSP) 和 Jones 建 立 的[51]甲 基 化 敏 感 的 单 碱 基 延 伸 技 术 (Ms-SNuPE), 都 需 要 建 立 在 电 泳 分 析 的 基 础 上 。 其 中 以NaHSO3 法 为 基 础 产 生 了 多 种 CpG 岛 甲 基 化 检 测 方 法 , 如 BSP 测 序 、PCR、 芯 片 杂 交 技术 等 特 异 DNA 甲 基 化 位 点 的 检 测 技 术 。 结 合 新 一 代 测 序 技 术 以 及 尚 待 开 发 的 高 通 量 甲 基化 图 谱 测 序 必 然 使 DNA 甲 基 化 初 步 研 究 上 升 到 深 层 方 面 的 研 究 , 包 括 营 养 / 死 亡 , 非 生[52]物 和 生 物 胁 迫 等 。 当 今 生 存 环 境 的 多 变 , 使 植 物 对 抗 逆 境 胁 迫 的 研 究 被 提 上 进 程 , 作为 后 基 因 组 研 究 的 热 点 ,DNA 甲 基 化 与 植 物 抗 旱 性 育 种 将 会 是 未 来 几 年 的 重 要 研 究 方 向之 一 。3.3 面 临 的 挑 战基 因 组 DNA 甲 基 化 运 用 到 植 物 抗 旱 性 育 种 中 存 在 若 干 问 题 :(1)、 植 物 甲 基 化 修 饰对 逆 境 胁 迫 响 应 的 灵 活 性 与 动 态 可 逆 性 一 方 面 可 避 免 植 物 免 受 环 境 的 伤 害 , 另 一 方 面 也造 成 了 我 们 研 究 的 困 难 , 只 要 时 机 没 有 把 握 准 确 将 可 能 造 成 巨 大 的 实 验 误 差 。(2)、 利 用DNA 甲 基 化 修 饰 育 种 起 步 较 晚 , 仅 有 的 一 些 例 子 多 是 利 用 5 氮 杂 胞 苷 /5’-aza-2’ 脱 氧 胞 苷[43]处 理 植 株 , 造 成 整 体 甲 基 化 水 平 降 低 或 升 高 , 诱 导 新 性 状 用 于 育 种 , 如 矮 杆 水 稻 [43][53]等 ; 也 有 运 用 到 杂 种 优 势 等 作 物 改 良 的 育 种 当 中 , 但 是 都 集 中 在 分 析 亲 本 与 后 代 的DNA 甲 基 化 水 平 。(3)、 基 因 组 DNA 甲 基 化 作 图 尚 处 于 起 步 阶 段 , 其 方 法 类 似 于 经 典 遗[54]传 学 中 的 测 序 。 目 前 第 一 张 高 分 辨 率 的 DNA 甲 基 化 图 谱 为 拟 南 芥 , 利 用 免 疫 沉 淀 和Tiling 芯 片 的 结 合 首 次 成 功 的 检 测 了 拟 南 芥 基 因 组 甲 基 化 胞 嘧 啶 分 布 , 而 其 他 植 物 尚 未 见类 似 的 报 道 。 分 子 标 记 在 理 论 上 是 可 以 运 用 到 DNA 甲 基 化 等 位 基 因 的 选 择 的 , 但 在 育 种实 践 中 存 在 困 难 , 目 前 较 为 常 用 的 甲 基 化 分 子 标 记 技 术 是 MSAP。 新 一 代 测 序 技 术 的 开发 为 全 基 因 组 DNA 甲 基 化 和 目 标 基 因 甲 基 化 的 检 测 创 造 了 可 能 , 比 如 Solexa 测 序 其 数[55]字 信 号 的 获 得 、 无 杂 交 干 扰 因 素 和 不 需 要 PCR 扩 增 , 使 其 更 优 越 与 芯 片 技 术 可 增 加 全[56]基 因 组 甲 基 化 图 谱 的 精 度 和 深 度 。Shivani 等 人 发 明 了 一 种 能 够 检 测 目 的 片 段 CpG 甲基 化 水 平 的 捕 获 和 捆 绑 技 术 ——mTACL, 是 一 种 能 够 平 行 测 定 多 个 样 品 几 十 万 个 CpG 的[57]高 通 量 检 测 方 法 , 但 是 这 种 方 法 受 到 PCR 样 品 容 量 的 限 制 , 需 要 花 费 人 力 、 物 力 和 财[57]力 , 可 通 过 使 用 Oligo 探 针 杂 交 芯 片 技 术 的 方 法 来 改 善 。 此 外 ,Wang 等 已 经 获 得 水 稻[58]抗 旱 性 基 因 的 时 空 表 达 图 谱 , 结 合 新 DNA 甲 基 化 检 测 技 术 , 这 将 为 DNA 甲 基 化 在 水稻 抗 旱 性 育 种 的 应 用 鉴 定 基 础 。4 小 结DNA 甲 基 化 作 为 一 种 重 要 的 表 观 遗 传 现 象 , 通 过 多 种 甲 基 转 移 酶 的 作 用 , 能 够 在 不改 变 DNA 系 列 的 情 况 下 调 节 植 物 基 因 组 的 功 能 。 因 DNA 甲 基 化 修 饰 对 逆 境 胁 迫 的 响 应40
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