01990R2676-20050813 - EUR-Lex

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▼B ▼M8 2.2.3. Espressione dei risultati La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale in milliequivalenti, è uguale a: 5 n. La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale, in grammi di acido tartarico, è uguale a: 0,375 n. La quantità di acido tartarico per litro di vino espresso con una cifra decimale, in grammi di tartrato acido di potassio, è uguale a: 0,470 n. 1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 100
▼B 1. PRINCIPIO DEI METODO 17. ACIDO CITRICO L'acido citrico viene trasformato in ossalacetato e acetato in una reazione catalizzata dalla citrato-liasi (CL): citrato ossalacetato + acetato In presenza della malato-deidrogenasi (MDH) e della lattato-deidrogenasi (LDH), l'ossalacetato e il suo derivato di decarbossilazione, il piruvato, vengono ridotti dal nicotinammide — adenina-dinucleotide ridotto (NADH) a L-malato ed a L-lattado: Ossalacetato + NADH + H + L-malato + NAD + Piruvato + NADH + H + L-lattato + NAD + In queste reazioni, la quantità di NADH ossidato a NAD + è proporzionale al citrato presente. L'ossidazione dell'NADH viene misurata dalla diminuzione della sua assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm. 2. REATTIVI 2.1. Tampone a pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH 7,8 Zn 2+ : 0,6 ∙ 10 − 3 M): sciogliere in circa 70 ml di acqua bidistillata 7,13 g di glicilglicina; portare il pH a 7,8 con circa 13 ml di soluzione di idrossido di sodio 5 M; addizionare 10 ml di soluzione di cloruro di zinco ZnCl 2 80 mg/ 100 ml; portare a 100 ml con acqua bidistillata. La soluzione rimane stabile a + 4 °C per almeno 4 settimane. 2.2. Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide ridotto (NADH), circa 6 ∙ 10 − 3 M, sciogliere 30 mg di NADH e 60 mg di NaHCO 3 in 6 ml di acqua bidistillata. 2.3. Soluzione di malato deidrogenasi/lattato deidrogenasi (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg/ml): miscelare 0,1 ml di MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml di soluzione di solfato di ammonio (3,2 M) l 0,5 ml di LDH (5 mg/ml). A 4 °C questa sospensione si mantiene stabile per almeno un anno. 2.4. Citrato-liasi CL (5 mg di proteina/ml): sciogliere in un ml di acqua ghiacciata 168 mg di liofilizzato. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno una settimana e se congelata per almeno 4 settimane. Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività dell'enzima. 2.5. Polivinilpolipirrolidone (PVPP) Nota: L'insieme dei reattivi necessari per la determinazione si trova pronto in commercio. 3. APPARECCHIATURA 3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento dell'NADH. In alternativa si può usare, il fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misure assolute di assorbanza (senza curva di taratura ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio. 3.2. Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso. 3.3. Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml. 1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 101
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