01990R2676-20050813 - EUR-Lex

▼B
1. PRINCIPIO DEI METODO
17. ACIDO CITRICO
L'acido citrico viene trasformato in ossalacetato e acetato in una
reazione catalizzata dalla citrato-liasi (CL):
citrato ossalacetato + acetato
In presenza della malato-deidrogenasi (MDH) e della lattato-deidrogenasi
(LDH), l'ossalacetato e il suo derivato di decarbossilazione, il
piruvato, vengono ridotti dal nicotinammide — adenina-dinucleotide
ridotto (NADH) a L-malato ed a L-lattado:
Ossalacetato + NADH + H + L-malato + NAD +
Piruvato + NADH + H + L-lattato + NAD +
In queste reazioni, la quantità di NADH ossidato a NAD + è proporzionale
al citrato presente. L'ossidazione dell'NADH viene misurata dalla
diminuzione della sua assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm.
2. REATTIVI
2.1. Tampone a pH 7,8
(glicilglicina 0,51 M; pH 7,8 Zn 2+ : 0,6 ∙ 10 − 3 M):
sciogliere in circa 70 ml di acqua bidistillata 7,13 g di glicilglicina;
portare il pH a 7,8 con circa 13 ml di soluzione di idrossido di sodio 5
M; addizionare 10 ml di soluzione di cloruro di zinco ZnCl 2 80 mg/
100 ml; portare a 100 ml con acqua bidistillata.
La soluzione rimane stabile a + 4 °C per almeno 4 settimane.
2.2. Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide ridotto (NADH),
circa 6 ∙ 10 − 3 M, sciogliere 30 mg di NADH e 60 mg di NaHCO 3 in
6 ml di acqua bidistillata.
2.3. Soluzione di malato deidrogenasi/lattato deidrogenasi (MDH/LDH)
(0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg/ml): miscelare 0,1 ml di MDH (5 mg
MDH/ml), 0,4 ml di soluzione di solfato di ammonio (3,2 M) l 0,5
ml di LDH (5 mg/ml). A 4 °C questa sospensione si mantiene stabile
per almeno un anno.
2.4. Citrato-liasi CL (5 mg di proteina/ml): sciogliere in un ml di acqua
ghiacciata 168 mg di liofilizzato. Alla temperatura di 4 °C la
soluzione si mantiene stabile per almeno una settimana e se congelata
per almeno 4 settimane.
Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività
dell'enzima.
2.5. Polivinilpolipirrolidone (PVPP)
Nota:
L'insieme dei reattivi necessari per la determinazione si trova pronto in
commercio.
3. APPARECCHIATURA
3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo
di assorbimento dell'NADH.
In alternativa si può usare, il fotometro a spettro discontinuo con
lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misure
assolute di assorbanza (senza curva di taratura ma con riferimento al
coefficiente di estinzione del NADH), occorre controllare le scale
delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.
3.2. Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso.
3.3. Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml.
1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 101