01990R2676-20050813 - EUR-Lex

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▼B Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione. Nota: misura a 334 nm C = 0,482 × ΔA misura a 365 nm C = 0,876 × ΔA 6.2. Ripetibilità (r) r = 0,03 + 0,034 xi = concentrazione in acido malico del campione espressa in g/l. x i 6.3. Riproducibilità (R) R = 0,05 + 0,071 xi = concentrazione in acido malico del campione in g/l. x i 1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 110
▼M7 1. PRINCIPIO 20. ACIDO D-MALICO (dosaggio con metodo enzimatico) In presenza di D-malato-deidrogenasi (D-MDH), l'acido D-malico (Dmalato) viene ossidato in ossalacetato dalla nicotinammide-adeninadinucleotide (NAD). L'ossalacetato formato è trasformato in piruvato e biossido di carbonio. D-malato + NAD + piruvato + CO 2 + NADH + H + La formazione di NADH, misurata tramite l'aumento dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 334, 340 o 365 nm, è proporzionale alla quantità di D-malato presente. 2. REATTIVI I reattivi che consentono circa 30 determinazioni si trovano in commercio in confezioni costituiti da un kit comprendente: a) Flacone n. 1 contenente circa 30 ml di soluzione tampone Hepes acido [N-(2-idrossietil)piperazin-N'-2-etano] solfonico, pH = 9,0 e stabilizzatori; b) Flacone n. 2 contenente circa 210 mg di NAD liofilizzato; c) Tre flaconi n. 3 contenenti D-MDH liofilizzato, con titolo 8 unità circa. Preparazione delle soluzioni 1. Utilizzare il contenuto del flacone n. 1 senza diluizione. Portare la soluzione a 20-25 °C prima dell'uso. 2. Sciogliere il contenuto del flacone n. 2 in 4 ml di acqua bidistillata. 3. Sciogliere il contenuto di uno dei flaconi n. 3 in 0,6 ml di acqua bidistillata. Portare la soluzione a 20-25 °C prima dell'uso. Stabilità delle soluzioni Il contenuto del flacone n. 1 si conserva a + 4 °C per almeno un anno; la soluzione 2 si conserva a + 4 °C per circa 3 settimane e a − 20 °C per due mesi; la soluzione 3 si conserva per 5 giorni a + 4 °C. 3. APPARECCHIATURA 3.1. Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento del NADH. In alternativa, può essere utilizzato un fotometro a spettro discontinuo in grado di effettuare misurazioni a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misure assolute dell'assorbanza (assenza di gamma di taratura, ma riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), devono essere controllate le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dello strumento. 3.2. Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso. 3.3. Micropipette che consentano di prelevare volumi compresi tra 0,01 e 2 ml. 4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il dosaggio del D-malato viene effettuato, di norma, direttamente sul vino senza decolorazione preliminare. La quantità di D-malato nella cella deve essere compresa tra 2 e 50 μg, e pertanto occorre diluire il vino in modo tale che la concentrazione di malato sia compresa tra 0,02 e 0,5 g/l oppure 0,02 e 0,3 g/l, a seconda dello strumento utilizzato. 1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 111
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