01990R2676-20050813 - EUR-Lex

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4.4. Soluzione 4: Esochinasi/glucosio-6-fosfato-deidrogenasi: miscelare 0,5
ml di esochinasi (2 mg di proteina/ml, cioè 280 U/ml) e 0,5 ml di
glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (1 mg di proteina per ml).
A + 4 °C la soluzione si conserva per un anno.
4.5 Soluzione 5: fosfoglucosio-isomerasi (2 mg di proteina per ml, cioè
700 U/ml). La sospensione viene utilizzata senza diluizione.
A + 4 °C circa la soluzione si conserva per un anno.
Nota:
l'insieme dei reattivi per il dosaggio si trova pronto in commercio.
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione del campione
Effettuare le seguenti diluizioni in funzione della quantità presunta di
glucosio + fruttosio per litro:
Misura a 340 e 334 nm 365 nm
Diluizione con
acqua
Fattore F di
diluizione
fino a 0,4 g/l 0,8 g/l — —
fino a 4,0 g/l 8,0 g/l 1+ 9 10
fino a 10,0 g/l 20,0 g/l 1+ 24 25
fino a 20,0 g/l 40,0 g/l 1+ 49 50
fino a 40,0 g/l 80,0 g/l 1+ 99 100
al di sopra di 40,0 g/l 80,0 g/l 1+999 1 000
5.2. Dosaggio
Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm,
effettuare le misure rispetto all'aria (senza la cella sul percorso ottico)
o rispetto all'acqua.
Temperatura 20—25 °C.
In 2 celle aventi un cammino ottico di 1 cm, introdurre:
Prova in bianco Campione
Soluzione 1 (4.1) (portata a 20
°C)
2,50 ml 2,50 ml
Soluzione 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml
Soluzione 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml
Campione da determinare 0,20 ml
Acqua bidistillata 0,20 ml
Mescolare e dopo circa 3 minuti leggere l'assorbanza delle soluzioni
(A 1 ). Provocare la reazione aggiungendo:
Soluzione 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml
Mescolare; aspettare 15 minuti; effettuare la misura dell'assorbanza e
verificare dopo 2 minuti che la reazione sia terminata (A 2 ).
Aggiungere immediatamente:
Soluzione 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml
Mescolare; effettuare la lettura dopo 10 minuti; verificare l'arresto della
reazione dopo 2 minuti (A 3 ).
Determinare le differenze di assorbanza:
A 2 − A 1 che corrisponde al glucosio,
A 3 − A 2 che corrisponde al fruttosio,
per la prova in bianco e per il campione.
1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001 — 72